慢性乙肝患者及HBV携带者CD8+T细胞表面活化分子CD38和HLA—DR表达研究

冯江+俞加正+郑洁怀+陈华忠

[摘要] 目的 研究慢性乙肝（CHB）患者阿德福韦酯治疗前后及HBV携带者CD8+T细胞表面活化分子CD38和HLA-DR表达情况，并探讨其与疾病进展的关系。 方法 收集32例经阿德福韦酯治疗的CHB患者，31例HBV携带者和28例正常对照，采集CHB患者治疗前后及HBV携带者和正常对照外周血。采用流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞数量和比例，以及CD8+CD38+和CD8+HLA-DR+T细胞比例，HBV DNA和生化由本院检验室检测。 结果 CHB患者治疗前CD8+CD38+T细胞比例显著高于HBV携带者和正常对照组，阿德福韦酯治疗后显著降低（P<0.05）。HBV携带者CD8+CD38+T细胞比例高于正常对照组（P<0.05）。CHB患者治疗前CD8+HLA-DR+T细胞比例显著高于正常对照组（P<0.01），但与HBV携带者无明显差异，阿德福韦酯治疗后显著下降，仍高于正常水平（P<0.05）。 结论 HBV感染可以引起CD8+T活化水平显著升高，阿德福韦酯抗病毒治疗能够降低CD8+T的活化。CD8+T活化水平是良好的HBV感染病情评价指标。

[关键词] HBV；慢性乙肝；免疫活化；CD38；HLA-DR

[中图分类号] R512.62 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）34-0014-04

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种非细胞致病性病毒，HBV感染的临床结果主要依赖于宿主的免疫应答情况。研究发现T细胞免疫应答对HBV感染的进展十分重要[1]，其中CD8+T细胞免疫应答对控制病毒的复制起主要作用[2]。缺乏高强度的、特异性的免疫应答是导致慢性乙肝（chronic hepatitis B，CHB）病毒清除失败和疾病进展的主要原因[3，4]。研究外周血T细胞免疫活化状态对揭示CHB发病机制具有重要意义，尤其是CD8+T细胞的免疫活化。CD38分子是一种表达在早期T细胞表面的糖蛋白，成熟以后消失，但是T细胞活化后又重新出现[5]。作为T细胞免疫活化的标志，CD38在许多急性或慢性感染中均会表达升高，如人类免疫缺陷病毒（HIV）、EB病毒（EBV）等感染[5，6]。另外一个T细胞免疫活化的指标是人类白细胞抗原-DR（HLA-DR），在HIV的感染中可作为预测疾病进展的指标之一[7]。到目前为止，对HBV感染者及CHB患者T细胞免疫活化的研究较少。本文对慢性乙肝患者阿德福韦酯治疗前后及HBV携带者CD8+T细胞表面活化分子CD38和HLA-DR表达情况进行研究，并探讨其与病毒复制和疾病进展的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取我院2010年6月～2011年6月接受阿德福韦酯抗病毒治疗的CHB者32例，其中男20例，女12例，平均年龄（50.2±22.4），平均病程（6.5±5.7）年。诊断标准符合2000年西安全国第10届病毒性肝炎会议所修订的《病毒性肝炎防治方案》诊断标准[3]，并排除其他病毒性肝炎、酒精、药物引起的肝损伤等。入组后接受阿德福韦酯10 mg/d 治疗12个月以上。另外，选取HBs抗原阳性的乙肝携带者31例，其中男22例，女9例，平均年龄（44.8±26.9）岁。以本院门诊体检者32人（均无特殊病史，体检无异常发现，anti-HBsAg（-），近2个月无感染史）作为正常对照组，男18例，女10例，平均年龄（42.1±20.6）岁。

1.2 样本的采集

采集慢性乙肝患者治疗前及治疗12个月后的外周血2 mL/人，以及HBV携带者和正常对照组血样2 mL/人，无菌EDTA抗凝管收集做流式细胞术检测，另外采集血样分别送化验室进行生化及HBVDNA等检测。

1.3 流式细胞术检测

荧光标记的单克隆抗体购自美国BD公司，CD4+和CD8+T细胞计数采用BD公司的细胞计数管，其余细胞比例检测采用普通流式管。每管加入50 μl血样及相应抗体，抗体组合如下：CD3-PE/CD4-FITC，CD3-PE/CD8-FITC，CD3-PE/CD8-FITC/CD38-APC，CD3-PE/CD8-FITC/HLA-DR-APC。标记好的血样室温避光孵育15 min，裂解红细胞后，采用BD公司FACScan四色流式细胞仪进行检测。

1.4 统计学分析

检测结果均以均数±标准差表示，应用SPSS 15.0软件进行数据分析，定量资料两组间数据比较采用t检验，多组间数据比较采用One-Way ANOVA（SNK法），相关性分析Persons检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHB患者、HBV携带者及对照组生化和免疫学比较

CHB患者平均治疗时间为（18.8±5.7）个月，治疗前后相比ALT、TBIL和HBV DNA均有显著下降（P<0.05），CD4+T细胞数量有所上升，CD8+T细胞数量下降（P均>0.05），但仍显著低于正常水平（P<0.01），CD4+T细胞比例改变不明显，CD8+T细胞比例治疗前显著高于正常对照组，治疗后与治疗前比显著下降（P<0.05）。HBV携带者HBV DNA显著高于CHB治疗前，CD4+T细胞数量和比例均高于CHB患者治疗前水平，但CD4+T细胞数量低于正常水平（P均<0.05），CD8+T细胞水平与其余组比较无显著差异。见表1。

2.2 各组CD8+T细胞免疫活化情况比较

CHB患者治疗前CD8+CD38+T细胞比例显著高于HBV携带者和正常对照组，阿德福韦酯治疗后显著降低，低于HBV携带者水平，但仍稍高于正常水平，HBV携带者CD8+CD38+T细胞比例高于正常对照组。以上P均<0.05，见图1A。

各组CD8+HLA-DR+T细胞比例均低于CD8+CD38+T细胞比例，CHB患者治疗前CD8+HLA-DR+T细胞比例显著高于正常对照组（P<0.01），但与HBV携带者无明显差异，阿德福韦酯治疗后显著下降，仍高于正常水平（P<0.05）。见图1B。

2.3 CD8+T细胞免疫活化与病毒学和免疫学指标的相关性分析

CD8+CD38+%和CD8+HLA-DR+%与HBV感染的病情指标均表现出良好地相关性。具体为CD8+CD38+%和CD8+HLA-DR+%与HBV DNA 和ALT水平呈正相关（P<0.05），与CD8+T细胞数呈负相关（P<0.05），与CD4+T细胞数也呈负相关，但P>0.05。见表2。

3 讨论

除了HBV DNA和肝功能外，T细胞的活化状态也是评价HBV感染的重要指标，但是目前这方面的研究报道不多。既往的研究发现，CHB患者与正常人群及HBV携带者相比，外周血T细胞亚群存在比例失衡，体现在CD8+T细胞比例增高、CD4+T细胞比例及CD4+/CD8+的下降[8，9]，这与我们的研究相符。在我们的研究中HBV感染能够引起CD8+T细胞的显著活化，并且CHB患者的活化程度高于HBV携带者，说明CD8+T细胞的活化参与了CHB的发病过程。许多研究发现，CD8+T细胞在病毒的清除和疾病的进展方面起有重要作用，CD8+T细胞的活化反映了CD8+T细胞清除病毒的能力[10，11]。但另一方面，CD8+T细胞的过度活化又会引起机体的免疫损伤，造成疾病进展。我们的研究发现，CD8+CD38+和CD8+HLA-DR+T细胞的比例与CD4+和CDC8+T细胞的数量呈反比，说明CD8+T细胞免疫活化可能是造成CHB患者和HBV携带者CD4+T细胞和CD8+T细胞数量下降的重要原因。Cao等[12]研究发现，在CHB患者中存在持续的慢性免疫活化，但不如在HIV和EBV感染中的强烈，这可能与HBV感染主要局限于肝脏有关。大量激活的T细胞，包括CD4+T细胞核CD8+T细胞，最终大部分会凋亡，只有少数会转化为静息型的记忆细胞存活下来。长期慢性的过度免疫活化导致HBV感染者CD4+和CD8+T细胞大量消耗，最后导致免疫功能下降，不能抑制病毒的复制，进展到慢性肝病期[13]。

CD38和HLA-DR分子做为T细胞免疫活化的标志，与许多病原体感染有关[5，6]。有研究发现，在HIV感染中，CD8+CD38+和CD8+HLA-DR+反映的免疫活化水平与HIV疾病的进展密切相关，CD4+T细胞的缺失与免疫活化水平有直接关系，CD8+CD38+和CD8+ HLA-DR+百分比比病毒载量更能反映机体的免疫活化情况[14，15]。我们的研究发现，在HBV感染中，CD8+CD38+和CD8+ HLA-DR+百分比与HBV DNA和ALT呈正相关，这与Cao等的研究结果一致。我们的研究结果提示，CD8+T细胞的活化程度与HBV造成炎症反应程度密切相关，是引起肝脏炎症损伤的重要原因之一。因此，免疫活化指标，尤其是CD8+T细胞上CD38和HLA-DR分子的表达是评价HBV感染者病情的良好指标。

此外，我们的研究还发现，阿德福韦酯抗病毒治疗不仅可以抑制CHB患者体内HBV的复制，使病毒载量显著下降，而且使免疫活化水平显著下降，接近正常水平，但仍然偏高。这一结果表明，CD8+T细胞的免疫活化的直接原因可能是HBV的大量复制，CD8+T细胞免疫活化程度与HBV DNA拷贝数的正相关也证明了这一点。另外，在HIV-1感染中的研究发现，接受高效抗逆转录病毒治疗的艾滋病患者，即使HIV复制被完全抑制，病毒载量下降到检测不到的水平，CD8+CD38+和CD8+ HLA-DR+T细胞的比例仍然高于正常水平，这可能是因为虽然病毒复制水平被抑制到检测限以下，但仍然有少量的病毒持续存在，使T细胞的免疫活化维持在较高水平[16]。对接受阿德福韦酯治疗的CHB患者的随访研究发现，CD8+T细胞的免疫活化在治疗开始的12周内就开始下降，并随着治疗时间的延长发生迅速、持续地降低，并有许多患者恢复到正常水平[12]。这些研究进一步证明，病毒颗粒本身是导致CD8+T细胞免疫活化的直接原因。因此，及时的、持续的抗病毒治疗，最大限度地降低病毒载量，是减少HBV感染者CD8+T细胞免疫活化的重要治疗措施。

综上，我们的研究表明，HBV感染可以导致机体CD8+T细胞的免疫活化，并且这种免疫活化与HBV感染病情进展有关，并可能参与了CHB的发病过程。阿德福韦酯不仅可以抑制HBV的复制，降低病毒载量，还可以通过降低CD8+T细胞的免疫活化，进而改善CHB患者的免疫状况，减少炎症损伤和T细胞的消耗。进一步的研究需要对接受抗病毒治疗CHB患者进行更长时间的随访。

[参考文献]

[1] Baumert TF，Thimme R，von WF. Pathogenesis of hepatitis B virus infection[J]. World J Gastroenterol，2007，13（1）：82-90.

[2] Maini MK，Boni C，Ogg GS，et al. Direct ex vivo analysis of hepatitis B virus-specific CD8（+） T cells associated with the control of infection[J]. Gastroenterology，1999， 117（6）：1386-1396.

[3] Bertoletti A，Gehring AJ. The immune response during hepatitis B virus infection[J]. J Gen Virol，2006，87（Pt 6）：1439-1449.

[4] Maini MK，Boni C，Lee CK，et al. The role of virus-specific CD8（+） cells in liver damage and viral control during persistent hepatitis B virus infection[J]. J Exp Med，2000，191（8）：1269-1280.

[5] Savarino A，Bottarel F，Malavasi F，et al. Role of CD38 in HIV-1 infection：An epiphenomenon of T-cell activation or an active player in virus/host interactions[J]. AIDS，2000， 14（9）：1079-1089.

[6] Zidovec LS，Vince A，Dakovic RO，et al. Increased numbers of CD38 molecules on bright CD8+ T lymphocytes in infectious mononucleosis caused by Epstein-Barr virus infection[J]. Clin Exp Immunol，2003，133（3）：384-390.

[7] Gascon RL，Narvaez AB，Zhang R，et al. Increased HLA-DR expression on peripheral blood monocytes in subsets of subjects with primary HIV infection is associated with elevated CD4 T-cell apoptosis and CD4 T-cell depletion[J].J Acquir Immune Defic Syndr， 2002，30（2）：146-153.

[8] Tsai SL，Chen PJ，Lai MY，et al. Acute exacerbations of chronic type B hepatitis are accompanied by increased T cell responses to hepatitis B core and e antigens. Implications for hepatitis B e antigen seroconversion[J]. J Clin Invest，1992，89（1）：87-96.

[9] Rehermann B，Lau D，Hoofnagle JH，et al. Cytotoxic T lymphocyte responsiveness after resolution of chronic hepatitis B virus infection[J]. J Clin Invest，1996，97（7）：1655-1665.

[10] Bofill M，Borthwick NJ. CD38 in health and disease[J]. Chem Immunol，2000，（75）：218-234.

[11] Tilling R，Kinloch S，Goh LE，et al. Parallel decline of CD8+/CD38++ T cells and viraemia in response to quadruple highly active antiretroviral therapy in primary HIV infection[J]. AIDS，2002，16（4）：589-596.

[12] Cao W，Qiu ZF，Li TS. Parallel decline of CD8+CD38+ lymphocytes and viremia in treated hepatitis B patients[J].World J Gastroenterol，2011，17（17）：2191-2198.

[13] 贾继东. 2010年《慢性乙型肝炎防治指南》更新要点[J].胃肠病学，2011，16（6）：321-322.

[14] Sousa AE，Carneiro J，Meier-Schellersheim M，et al. CD4 T cell depletion is linked directly to immune activation in the pathogenesis of HIV-1 and HIV-2 but only indirectly to the viral load[J]. J Immunol，2002，169（6）：3400-3406.

[15] Resino S，Seoane E，Gutierrez MD，et al. CD4（+） T-cell immunodeficiency is more dependent on immune activation than viral load in HIV-infected children on highly active antiretroviral therapy[J]. J Acquir Immune Defic Syndr，2006，42（3）：269-276.

[16] Rosso R，Fenoglio D，Terranova MP，et al. Relevance of CD38 expression on CD8 T cells to evaluate antiretroviral therapy response in HIV-1-infected youths[J]. Scand J Immunol， 2010，71（1）：45-51.

（收稿日期：2014-05-28）

[5] Savarino A，Bottarel F，Malavasi F，et al. Role of CD38 in HIV-1 infection：An epiphenomenon of T-cell activation or an active player in virus/host interactions[J]. AIDS，2000， 14（9）：1079-1089.

[6] Zidovec LS，Vince A，Dakovic RO，et al. Increased numbers of CD38 molecules on bright CD8+ T lymphocytes in infectious mononucleosis caused by Epstein-Barr virus infection[J]. Clin Exp Immunol，2003，133（3）：384-390.

[7] Gascon RL，Narvaez AB，Zhang R，et al. Increased HLA-DR expression on peripheral blood monocytes in subsets of subjects with primary HIV infection is associated with elevated CD4 T-cell apoptosis and CD4 T-cell depletion[J].J Acquir Immune Defic Syndr， 2002，30（2）：146-153.

[8] Tsai SL，Chen PJ，Lai MY，et al. Acute exacerbations of chronic type B hepatitis are accompanied by increased T cell responses to hepatitis B core and e antigens. Implications for hepatitis B e antigen seroconversion[J]. J Clin Invest，1992，89（1）：87-96.

[9] Rehermann B，Lau D，Hoofnagle JH，et al. Cytotoxic T lymphocyte responsiveness after resolution of chronic hepatitis B virus infection[J]. J Clin Invest，1996，97（7）：1655-1665.

[10] Bofill M，Borthwick NJ. CD38 in health and disease[J]. Chem Immunol，2000，（75）：218-234.

[11] Tilling R，Kinloch S，Goh LE，et al. Parallel decline of CD8+/CD38++ T cells and viraemia in response to quadruple highly active antiretroviral therapy in primary HIV infection[J]. AIDS，2002，16（4）：589-596.

[12] Cao W，Qiu ZF，Li TS. Parallel decline of CD8+CD38+ lymphocytes and viremia in treated hepatitis B patients[J].World J Gastroenterol，2011，17（17）：2191-2198.

[13] 贾继东. 2010年《慢性乙型肝炎防治指南》更新要点[J].胃肠病学，2011，16（6）：321-322.

[14] Sousa AE，Carneiro J，Meier-Schellersheim M，et al. CD4 T cell depletion is linked directly to immune activation in the pathogenesis of HIV-1 and HIV-2 but only indirectly to the viral load[J]. J Immunol，2002，169（6）：3400-3406.

[15] Resino S，Seoane E，Gutierrez MD，et al. CD4（+） T-cell immunodeficiency is more dependent on immune activation than viral load in HIV-infected children on highly active antiretroviral therapy[J]. J Acquir Immune Defic Syndr，2006，42（3）：269-276.

[16] Rosso R，Fenoglio D，Terranova MP，et al. Relevance of CD38 expression on CD8 T cells to evaluate antiretroviral therapy response in HIV-1-infected youths[J]. Scand J Immunol， 2010，71（1）：45-51.

（收稿日期：2014-05-28）

[5] Savarino A，Bottarel F，Malavasi F，et al. Role of CD38 in HIV-1 infection：An epiphenomenon of T-cell activation or an active player in virus/host interactions[J]. AIDS，2000， 14（9）：1079-1089.

[6] Zidovec LS，Vince A，Dakovic RO，et al. Increased numbers of CD38 molecules on bright CD8+ T lymphocytes in infectious mononucleosis caused by Epstein-Barr virus infection[J]. Clin Exp Immunol，2003，133（3）：384-390.

[7] Gascon RL，Narvaez AB，Zhang R，et al. Increased HLA-DR expression on peripheral blood monocytes in subsets of subjects with primary HIV infection is associated with elevated CD4 T-cell apoptosis and CD4 T-cell depletion[J].J Acquir Immune Defic Syndr， 2002，30（2）：146-153.

[8] Tsai SL，Chen PJ，Lai MY，et al. Acute exacerbations of chronic type B hepatitis are accompanied by increased T cell responses to hepatitis B core and e antigens. Implications for hepatitis B e antigen seroconversion[J]. J Clin Invest，1992，89（1）：87-96.

[9] Rehermann B，Lau D，Hoofnagle JH，et al. Cytotoxic T lymphocyte responsiveness after resolution of chronic hepatitis B virus infection[J]. J Clin Invest，1996，97（7）：1655-1665.

[10] Bofill M，Borthwick NJ. CD38 in health and disease[J]. Chem Immunol，2000，（75）：218-234.

[11] Tilling R，Kinloch S，Goh LE，et al. Parallel decline of CD8+/CD38++ T cells and viraemia in response to quadruple highly active antiretroviral therapy in primary HIV infection[J]. AIDS，2002，16（4）：589-596.

[12] Cao W，Qiu ZF，Li TS. Parallel decline of CD8+CD38+ lymphocytes and viremia in treated hepatitis B patients[J].World J Gastroenterol，2011，17（17）：2191-2198.

[13] 贾继东. 2010年《慢性乙型肝炎防治指南》更新要点[J].胃肠病学，2011，16（6）：321-322.

[14] Sousa AE，Carneiro J，Meier-Schellersheim M，et al. CD4 T cell depletion is linked directly to immune activation in the pathogenesis of HIV-1 and HIV-2 but only indirectly to the viral load[J]. J Immunol，2002，169（6）：3400-3406.

[15] Resino S，Seoane E，Gutierrez MD，et al. CD4（+） T-cell immunodeficiency is more dependent on immune activation than viral load in HIV-infected children on highly active antiretroviral therapy[J]. J Acquir Immune Defic Syndr，2006，42（3）：269-276.

[16] Rosso R，Fenoglio D，Terranova MP，et al. Relevance of CD38 expression on CD8 T cells to evaluate antiretroviral therapy response in HIV-1-infected youths[J]. Scand J Immunol， 2010，71（1）：45-51.

（收稿日期：2014-05-28）