ERK1/2参与IL—33诱导的心脏成纤维细胞增殖和纤维化过程

黄晓燕+杨曦+廉姜芳

[摘要] 目的 探讨ERK1/2通路在IL-33激活心脏成纤维细胞中的表达及其作用。 方法 培养心脏成纤维细胞，10 ng/mL IL-33刺激细胞，不同时间点MTT法检测IL-33对心脏成纤维细胞增殖的影响；RT-PCR检测细胞标志性基因α-SMA 及通路关键分子TRAF-6的mRNA表达水平；Western blot检测α-SMA 、TRAF-6及p-ERK1/2和ERK1/2的蛋白表达。 结果 IL-33能促进心脏成纤维细胞的增殖（P<0.05）；IL-33刺激细胞24h，TRAF-6表达显著上调（P<0.05），p-ERK1/2 蛋白水平表达明显高于对照组（P<0.05）；IL-33干预24h后α-SMA表达明显上调（P<0.05），ERK1/2特异性阻断剂PD98059可有效抑制该效应。 结论 ERK1/2通路参与了IL-33诱导的心脏成纤维细胞增殖和纤维化过程。

[关键词] IL-33/ST2信号通路；ERK1/2；心脏成纤维细胞

[中图分类号] R363 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）34-0004-04

心肌纤维化是心脏重构的重要组成部分，贯穿于心力衰竭发生发展的整个过程。已知心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFBs）过度增殖，胶原合成增多，排列紊乱是心肌纤维化的细胞病理学基础[1]。CFBs在应激下可转分化为肌成纤维细胞（myofibroblast，MyoFBs）[2，3]，合成细胞外基质（extracellular matrix，ECM）能力增强。平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是肌成纤维细胞的标记性蛋白。

白细胞介素-33（interleukin，IL-33）是近年来新发现的细胞因子，2005年被鉴定为白细胞介素-1（IL-1）类家族新成员。IL-33 与其受体ST2结合后，将活化信号传导到胞内，诱导Th2 细胞因子的产生，参与多种炎症反应和免疫应答[4，5]。其中肿瘤坏死因子受体相关因子-6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）是IL-33介导下游信号传导的关键信号分子。最近研究显示，IL-33/ST2与纤维化疾病存在密切联系，在肺纤维化、肝纤维化、心脏纤维化以及皮肤纤维化等纤维化疾病中发现 IL-33和/或ST2表达水平发生了变化。IL-33/ST2在心肌纤维化过程中发挥的具体作用机制，还有待于进一步研究。本实验旨在研究IL-33对心脏成纤维细胞增殖及纤维化过程中关键蛋白分子表达的影响以及下游通路活化的影响，探讨IL-33与心肌纤维化的关系，为进一步明确心肌纤维化的发病机制及寻求新的治疗靶点提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大鼠心脏成纤维细胞由本实验室保存。DMEM/F12培养基、胎牛血清购自HyClone公司。重组IL-33购自美国Peprotech公司，MTT试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。兔抗大鼠α-SMA抗体、TRAF-6抗体购自SANT CRUZ公司。兔抗大鼠ERK1/2和p-ERK1/2购自CST公司，内参GAPDH抗体购自Biolegend公司，碱磷酶标记山羊抗兔二抗、碱磷酶底物BCIP/NBT显色浓缩液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。ERK1/2特异性阻断剂PD98059购自美国Sigma公司。蛋白Marker购自美国Fermentas公司。RIPA 蛋白裂解液购自碧云天公司，RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。RT-PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司。根据GenBank序列设计引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 大鼠心脏成纤维细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃、5%CO2培养箱中常规培养。

1.2.2 MTT 比色法检测细胞增殖实验 取对数生长期细胞，以0.5×104/孔接种于96孔培养板中，每组设5个复孔，并设调零孔，每孔体积200 μL。细胞经IL-33分别诱导24、48及72 h，每孔加MTT 20 μL（5 mg/mL），继续孵育4 h。终止培养，吸弃上清，每孔加DMSO 150 μL，置摇床上低速振摇10 min，使结晶充分溶解。酶联免疫仪490 nm测吸光度值。上述实验重复3次。

1.2.3 RT-PCR检测标记性基因 α-SMA及信号通路关键因子TRAF-6的mRNA表达变化 取对数期生长细胞，消化后调整密度至5×105/mL 接种于培养瓶。无血清培养基同步化饥饿12 h，再以10 ng/mL IL-33诱导24 h，其中检测α-SMA时用40μM PD98059预处理60 min，RNA提取试剂盒提取总RNA，逆转录成cDNA。α-SMA上游引物：5'- ACTCTCTTCCAGCCATCTTTCATT-3'，下游引物：5'-CTTCGTCGTATTCCTGTTTGCT-3'；TRAF-6上游引物：5'- TCTCCCCTGCCTTCATTGTT-3'，下游引物：5'-AGGCTGGCGAT-TTTGTGTTT-3'；β-actin上游引5'-ACGGTCACAG-GTCATCACTATCG-3'，下游引物：5'- GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3'。扩增条件：95℃预变性2 min；95℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸30 s，40个循环。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察扫描并进行电泳条带分析，以目的条带与β-actin条带的比值作为目的条带的相对值。各组实验均重复3次。

1.2.4 Western blot检测α-SMA、TRAF-6、ERK1/2 和p-ERK1/2蛋白表达 细胞以10 ng/mL IL-33诱导24 h，其中检测α-SMA时用40μM PD98059预处理60 min，收集细胞，预冷PBS洗涤2次，加入200 μL RIPA裂解液（每1 mL裂解液中加10 μL PMSF），冰上裂解30 min，超声，4℃、12000 rpm离心10 min，取上清。Bradford法测定蛋白含量。4∶1体积比加入上样缓冲液，100℃ 5 min变性。每孔上样等量总蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。30v转膜150 min，含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1h。TBST洗膜3次，分别加入一抗α-SMA（1∶1000稀释）、TRAF-6、ERK1/2和p-ERK1/2（1∶400稀释），4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加入对应二抗（1∶500稀释），室温孵育1 h。最后BCIP/NBT显色液暗处显色观察，凝胶成像系统扫描分析，磷酸化水平用磷酸化蛋白和总蛋白的相对值表示，目的蛋白水平用目的蛋白和内参蛋白的相对值表示。各组实验均重复3次。

1.3 统计学分析

数据采用SPSS 13.0 统计学软件进行，所有实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t法，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-33对心脏成纤维细胞增殖的影响

加入10 ng/mL IL-33刺激细胞培养24、48、72 h 后，各组细胞生长状态良好，随着培养时间的延长，细胞数量不断增多。MTT结果显示，与未刺激组比较，IL-33明显诱导细胞增殖（P<0.05），见表1。

2.2 IL-33对TRAF-6 mRNA和蛋白水平的影响

与对照组相比，TRAF-6 mRNA和蛋白水平均明显上升（P<0.05），见图1和表2。表明IL-33诱导心脏成纤维细胞时，活化其下游信号。

2.3 IL-33对p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表达的影响

Western- blot 结果显示，IL- 33刺激心脏成纤维细胞后ERK1/2总蛋白无明显变化，而p-ERK1/2蛋白表达明显升高，与对照组比较，有显著性差异（P<0.05），见图1和表2。表明IL-33/ST2-TRAF-6 信号通路激活后，引起下游ERK1/2通路的参与。

2.4 IL-33对α-SMA mRNA和蛋白水平的影响

α-SMA是肌成纤维细胞的标记性蛋白。我们结果显示，IL- 33刺激成纤维细胞24 h后，α-SMA mRNA和蛋白表达明显上调（P<0.05）；40 μM PD98059预处理60 min后，α-SMA水平较单纯刺激组显著减弱，差异具有统计学意义（P<0.05），见图1和表3。表明IL-33诱导了心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化，这一过程可以被ERK1/2特异性阻断剂所抑制。

3 讨论

心力衰竭是各种危重心血管疾病的终末阶段，由于心肌损伤，引起心肌间质纤维化、心肌肥大和心功能不良，限制心肌细胞活动，降低心室顺应性，影响心肌的收缩和舒张功能，导致心脏重构[6，7]。在慢性炎症过程中，有多种炎症细胞参与，并释放多种炎症因子，导致肌成纤维细胞的形成并大量分泌ECM，最终导致纤维化[2，8-9]。因此确切认识心肌纤维化发生机制，有针对性地采取措施，进而有效预防和逆转心肌纤维化，对心衰的早期治疗也有着重要意义。

研究发现IL-33广泛存在于多种组织和细胞上，如成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和上皮细胞，在哮喘、自身免疫性疾病、糖尿病、血管炎症、抗动脉粥样硬化、抗心肌细胞肥大和心肌纤维化的过程中发挥重要作用[10]。IL-33可特异性激活ST2，ST2基因编码产生两种蛋白：跨膜形式ST2L和分泌形式sST2。在生物机械压力的诱导下， 心肌细胞和心脏成纤维细胞均能表达ST2。在IL-33/ST2信号通路中，IL-33与ST2L、IL-1受体辅助蛋白（IL-1 receptor accessory protein，IL-1RAcP）组成受体复合物，活化下游信号TRAF6、转化生长因子相关-1（TAK1），进而激活p38、JNK、NF-kB 等通路发挥生物学作用。sST2可负向调节IL-33/ST2通路的传导[4]。有研究证实，TRAF6 是IL-33介导p38、JNK 和NF-kB活化的关键信号分子[5，11-13]。本研究发现，IL-33能诱导心脏成纤维细胞明显表达TRAF-6，表明有IL-33/ST2通路的激活。

促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在许多心血管疾病的发病机制中起着重要作用，如心肌肥厚、心肌纤维化及心力衰竭等[13，14]。MAPK包括p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶（JNK）/应急激活的蛋白激酶（SAPK）及细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）三条通路，其中ERK1/2是心肌梗死后心室重塑的重要信号通路之一[15，16]。有研究报道，醛固酮通过激活ERK1/2 而刺激心脏成纤维细胞增殖，而且抑制ERK1/2活化能抑制IL-1β 诱发的基质金属蛋白酶-9（MMP-9）分泌[15-17]。我们的研究结果发现，在心脏成纤维细胞中IL-33 /ST2 通路活化后能进一步激活下游ERK1/2通路。已知α-SMA是肌成纤维细胞的标记性蛋白，成纤维细胞增殖、活化后其表达升高。本研究通过IL- 33诱导建立纤维化细胞模型，在这一过程中α-SMA 基因和蛋白水平明显表达，并且这一效应能被ERK1 /2特异性阻断剂PD98059所阻断。因此，IL- 33能诱导心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化，这一过程有IL-33/ST2-TRAF-6- ERK1/2通路参与调控。当然目前对IL-33在心肌纤维化中的作用机制还有待于进一步阐明，期望能为心肌纤维化治疗研究提供新思路。

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