温针灸对吗啡戒断大鼠学习记忆能力及前额叶皮质区 CaMKⅡ含量的影响

孙远征,范鸿莹,刘铁镌,武文鹏

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院,哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学,哈尔滨 150040)

·动物实验·

温针灸对吗啡戒断大鼠学习记忆能力及前额叶皮质区 CaMKⅡ含量的影响

孙远征1,范鸿莹2,刘铁镌2,武文鹏1

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院,哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学,哈尔滨 150040)

目的观察温针灸对吗啡成瘾戒断后大鼠学习记忆能力及前额叶皮质区钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)含量的影响,并进一步探讨其作用机制。方法将40只清洁级雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、手针组和温针组,每组10只。模型组、手针组和温针组大鼠背部皮下注射吗啡,逐日递增吗啡的注射剂量,成瘾后给予纳洛酮快速戒断,建立吗啡成瘾戒断后 SD大鼠模型。采用水迷宫试验测定各组大鼠的学习记忆能力,并采用免疫组化法测定各组大鼠前额叶皮质区 CaMKⅡ含量。结果对照组、手针组及温针组大鼠平台逃避平均潜伏期、穿越平台次数及PFC区CaMKⅡ含量与模型组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。温针组大鼠平台逃避平均潜伏期、穿越平台次数及PFC区CaMKⅡ含量与手针组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论温针灸治疗可以恢复吗啡戒断后大鼠的学习记忆能力,其作用机制可能与吗啡戒断后前额叶皮质区 CaMKⅡ含量增加有关。

温针疗法;吗啡依赖;水迷宫;钙调蛋白激酶Ⅱ;大鼠

近年来吗啡成瘾成为一个备受关注的热点,其所带来的危害也越来越大。目前医学界对于成瘾有了一个全新认识,认为药物成瘾是一种恶性学习记忆的过程。一方面,吗啡成瘾对学习记忆会造成损害;另一方面,多次给予吗啡又可引起记忆的恢复和重新巩固[1-2],一些不好的用药记忆得到了加深,使成瘾者对药物产生强烈的渴求,进而会诱发复吸。成瘾和学习记忆之间具有共同的信号转导过程,研究证实,Ca2＋-CaM-CaMK信号转导通路在吗啡成瘾中起到了重要的作用[3]。同时,边缘系统海马、杏仁核和前额叶皮质(PFC)脑区/核团是调节情绪与学习记忆的重要结构[4-5]。本研究通过建立吗啡戒断后大鼠模型,观察温针灸对吗啡成瘾戒断大鼠学习记忆能力及PFC脑区CaMKⅡ含量的影响,进一步探讨其作用机制。为针刺治疗戒毒寻找更有效的方法以及温针灸在防止复吸的应用上提供更加可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

清洁级雄性SD大鼠40只,体重为(180±20) g,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。按随机分组的原则随机分为对照组、模型组、手针组和温针组,每组10只。每5只饲养于1只笼中,适应性喂养1星期后用于动物实验。

1.2 试剂与仪器

盐酸吗啡(10 mg/mL,批号 H21022436),由沈阳第一制药厂提供,盐酸纳洛酮(1 mL/mg,批号H20066624),由吉林敖东药业集团股份有限公司提供;戊二醛,由上海生物工程有限公司提供;多聚甲醛,由上海溶剂厂提供;免疫组化检测试剂盒(二抗 PV6001),由北京中山技术有限公司提供。

1.3 建立大鼠吗啡戒断模型

参考有关文献[6],本实验采用背部皮下注射吗啡的方法。第1天吗啡注射剂量为20 mg/kg,以后每日递增10 mg/kg,连续注射5 d,每日所需剂量分2次注射(上午8:00及下午4:00)。于末次注射吗啡后3 h,腹腔注射纳洛酮3 mg/kg快速戒断,激发戒断症状。参照改良柳田知司法,观察戒断症状(湿狗样抖动、站立、跳跃、洗脸、齿颤、激惹、腹泻等),进行评分,确定模型建立成功。对照组于每天相同时间、相同方法注射同剂量的生理盐水。

1.4 实验组动物处理

1.4.1 温针组

将大鼠固定于治疗台上,按照《大鼠穴位图谱》[7]取百会及双侧肾俞、足三里穴,采用苏州医疗用品厂有限公司出品的0.35 mm×13 mm毫针进行针刺,得气后在针尾缠绕艾绒点燃施灸15 min。每日1次,连续治疗6 d。

1.4.2 手针组

取穴同温针组,针刺得气后留针 15 min。每日 1 次,连续治疗6 d。

此外,对照组及模型组大鼠采用与温针组相同方法固定,每次15 min,每日1次,连续6 d,期间不施加其他任何干预措施。

1.5 指标观察与检测

1.5.1 PFC区CaMKⅡ含量的测定

采用PV 免疫组化二步法,按试剂盒步骤操作。采用Image-pro plus6.0病理图像分析系统对阳性表达进行定量分析,测定PFC区CaMKⅡ的平均灰度值(平均灰度值与蛋白含量成反比)。

1.5.2 水迷宫测试

①于治疗第 3日开始定位航行试验,测试大鼠空间学习能力。将大鼠面向池壁,随机从不同象限置入池内,记录在1 min内大鼠找到平台的时间,即逃避潜伏期(前2 d训练中,若1 min内不能找到平台,可帮助其找到平台,并停留10 s)。②于第6日进行空间探索试验,测试大鼠空间记忆能力,即撤除平台,将大鼠由任一象限置入水中,记录1 min内大鼠的游泳轨迹及跨越平台次数。

1.6 统计学方法

实验数据均采用 SPSS19.0统计软件包进行方差分析。计量资料以均数±标准差表示,采用独立样本t检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠戒断症状比较

由表1可见,吗啡迅速戒断后,除对照组无明显戒断症状外,模型组、手针组及温针组均具有明显戒断症状(P＜0.01),说明大鼠吗啡戒断模型建立成功,可以满足进一步实验需要。

表1 各组大鼠吗啡戒断症状评分比较 (±s,分)

表1 各组大鼠吗啡戒断症状评分比较 (±s,分)

注:与对照组比较1)P＜0.01

组别 n 戒断症状评分值对照组 10 1.70±0.68模型组 10 27.11±4.201)手针组 10 27.00±6.481)温针组 10 22.44±4.561)

2.2 水迷宫测试结果

2.2.1 各组大鼠平台逃避平均潜伏期比较

随着训练次数的增加,各组大鼠寻找平台的逃避潜伏期有了明显的变化。由表2可见,模型组大鼠平台逃避平均潜伏期与对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较,手针组和温针组大鼠平台逃避平均潜伏期均明显缩短(P＜0.01),提示手针组和温针组改善大鼠空间学习能力均优于模型组。温针组大鼠平台逃避平均潜伏期与手针组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表2 各组大鼠平台逃避平均潜伏期比较 (±s,s)

表2 各组大鼠平台逃避平均潜伏期比较 (±s,s)

注:与模型组比较1)P＜0.01;与手针组比较2)P＜0.05

组别 n 第3天 第4天 第5天对照组 10 18.93±7.591) 14.96±4.631) 10.04±3.451)模型组 10 50.52±6.46 47.91±4.27 44.03±4.39手针组 10 37.95±11.861) 31.31±8.841) 27.99±9.271)温针组 10 33.82±8.981)2) 28.08±7.901)2) 24.65±6.811)2)

2.2.2 各组大鼠穿台次数比较

撤除平台后,各组大鼠依照记忆寻找原平台。由表3可见,模型组大鼠穿台次数与对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较,手针组和温针组大鼠穿越平台次数均明显增加(P＜0.01),提示手针组和温针组改善大鼠空间记忆能力优于对照组。温针组大鼠穿台次数与手针组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表3 各组大鼠穿台次数比较 (±s,次)

表3 各组大鼠穿台次数比较 (±s,次)

注:与模型组比较1)P＜0.01;与手针组比较2)P＜0.05

组别 n 穿台次数对照组 10 6.25±1.331)模型组 10 2.11±1.28手针组 10 3.22±1.731)温针组 10 4.39±1.501)2)

2.3 各组大鼠PFC区CaMKⅡ含量比较

由表 4可见,对照组、手针组及温针组大鼠 PFC 区 CaMKⅡ含量与模型组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。温针组大鼠PFC区CaMKⅡ含量与手针组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表4 各组大鼠PFC区CaMKⅡ含量比较 (±s,mg/L)

表4 各组大鼠PFC区CaMKⅡ含量比较 (±s,mg/L)

注:与模型组比较1)P＜0.01;与温针组比较2)P＜0.05

组别 n 平均灰度值对照组 10 183.67±9.351)模型组 10 146.33±10.97手针组 10 158.50±7.181)温针组 10 172.50±9.731)2)

3 讨论

CaMKⅡ是一种多功能的蛋白激酶,其自身磷酸化状态控制酶的活性参与学习记忆的过程,是空间学习记忆的分子基础。研究证实[8-10],慢性吗啡成瘾会使脑内的CaMKⅡ活性降低,吗啡戒断则会使脑内CaMKⅡ的活性明显增高。相关脑区内CaM和CaMKⅡ活性的过度增高会影响吗啡戒断症状的出现[11]。本实验中,经纳洛酮快速戒断后,手针组与温针组大鼠PFC脑区CaMKⅡ平均灰度值明显高于模型组,温针组大鼠 CaMKⅡ平均灰度值更接近于空白组,说明通过温针治疗,吗啡戒断后大鼠PFC脑区内过度增高的CaMKⅡ活性降低到接近正常水平。温针灸作用于吗啡戒断的机制可能与 PFC脑区内CaMKⅡ含量的改变有关。本次水迷宫测试结果显示,经治疗后,吗啡戒断大鼠的学习记忆损害得到恢复,且温针灸组的疗效更显著。笔者推测吗啡戒断后大鼠PFC脑区内CaMKⅡ活性过度增高可能与吗啡戒断后脑内突触结构及功能发生改变有关[12],引起吗啡成瘾恶性记忆的形成,影响了大鼠正常的学习记忆能力。

艾灸具有温经通络、扶正祛邪、行气活血、调节各脏腑功能及增强机体抵抗能力等作用[13-16]。针刺本身作为一种有效的刺激中枢神经系统的方法,对吗啡戒断症状有明显的改善作用[17-19],根据现代医学研究及经络特性选取足三里、肾俞、百会穴,结合针刺与艾灸的双重功效,集针、灸作用于一体。在我们的研究中发现,温针对吗啡戒断的治疗作用非常显著,可以恢复其伴随戒断症状出现的学习记忆能力损害。本研究为温针改善吗啡戒断大鼠学习记忆能力提供了较为重要的实验依据,温针灸可以成为临床上防止复吸的一种有效治疗方法,但有关温针灸对吗啡戒断大鼠学习记忆的作用及其机制有待于进一步的研究。

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Effect of Warm Needling on Learning and Memory Abilities and the CaMKⅡ Content of Prefrontal Cortex Area in Morphine Withdrawal Rats

SUN Yuan-zheng1, FAN Hong-ying2, LIU Tie-juan2, WU Wen-peng1. 1.Helongjiang University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital,Harbin 150001,China; 2.Helongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040,China

ObjectiveTo investigate the effect of warm needling on learning and memory abilities and the calmodulin kinaseⅡ(CaMK Ⅱ) content of prefrontal cortex area in morphine withdrawal rats and explore the mechanism of its action.MethodsForty clean-grade male SD rats were randomly allocated to control, model, manual needling and warm needling groups, 10rats each. A SD rat model of morphine addiction and withdrawal was made by dorsal subcutaneous injection of day-by-day incremental morphine and rapid withdrawal with Naloxone after addiction. Learning and memory abilities were tested using a Morris water maze and the CaMKⅡ content of prefrontal cortex area was measured by an immunohistochemical method in every group of rats.ResultsThere were statistically significant differences in mean platform escape latency, the number of platform crossing and the CaMKⅡ content of PFC area between the control, manual needling or warm needling group of rats and the model group (P＜0.01). There were statistically significant differences in mean platform escape latency, the number of platform crossing and the CaMKⅡ content of PFC area between the warm needling and manual needling groups (P＜0.05).Conclusions Warm needling treatment can restore learning and memory abilities in morphine withdrawal rats. The mechanism of its action may be related to an increase in the CaMKⅡ content of prefrontal cortex area.

Needle warming therapy; Morphine dependence; Water maze; Calmodulin kinaseⅡ; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.03.0253

1005-0957(2015)03-0253-03

2014-10-12

黑龙江省教育厅基金项目(12521496);哈尔滨市科技局项目(2012RFQXS052);黑龙江中医药大学优秀创新人才支持计划项目(2012RCQ04)

孙远征(1957 - ),男,主任医师

武文鹏(1982 - ),男,主治医师