基于微创光纤探头的荧光检测系统设计

陆想想，钱志余，李韪韬，汤飞飞

（南京航空航天大学 生物医学工程系，江苏 南京 210016）

越来越多的研究领域需要检测生物组织的荧光强度变化[1]。用于荧光检测的仪器有荧光分光光度计、CCD相机、光纤光谱仪等。荧光分光光度计具有非常高的精密度，对微弱信号有着较好的适应性，但只能应用于离体检测[2]。CCD相机能够观测到生物体整体的荧光强度分布情况，且有比较高的分辨率，但是不便于进行连续长时间的在体荧光检测[3]。光纤光谱仪虽然可以通过光纤，实现在体检测，但是检测灵敏度有限[4－5]。

本文提出采用高灵敏度的光电倍增管（Photomultiplier Tube，PMT）作为核心探测器[6]，使用高速数据采集卡进行数据采集，采用虚拟仪器技术，以Labview为信息处理平台，设计采集系统软件。同时设计了适用于在体检测的微创光纤探头，探头可直接深入生物组织。光纤探头的顶端安装有聚焦透镜，将光聚焦到光纤中可以提高微弱信号的检测效率。光纤探头获得的光信号通过光电检测系统处理，转换为电信号，进过数据采集卡进入上位机后可实时显示荧光强度的变化。

1 光电检测系统设计

1.1 系统总体结构

系统由光电探测模块、PMT分压与外部供电模块、信号预处理模块和上位机信号实时动态显示等部分组成。

图1 荧光检测系统结构框图Fig.1 Structure diagram of the fluorescence detection system

为了满足生物组织内部荧光信号的探测，采用微创光纤探头深入组织发光部位，采集微弱荧光信号。所用的光纤为春晖科技公司生产的石英光纤，有效工作波长200～1200 nm，根据实际探测需要，可给探头装配聚焦透镜，达到汇聚微弱荧光的作用，提高信号的检测效率。

生物组织的荧光信号比较微弱，在检测过程中容易受到背景噪声的干扰，将待检测的有用信号完全淹没在噪声中。为光电倍增管设计了金属屏蔽罩。金属屏蔽罩有两点重要的作用，一是可以屏蔽背景杂光，二是电磁屏蔽，防止信号处理电路产生的电磁波对光电倍增管的影响。屏蔽罩需要接地。在光电倍增管与光纤的入射窗之间加入适当的滤光片，保证只有特定波段的光通过。

1.2 PMT分压与供电电路设计

由一系列电阻构成分压器提供PMT各倍增极之间的电压，如图2所示。

在理想情况下，分压器回路各个倍增级之间的电压是均等的，流过各级分压电阻的电流IR为：

式中UH是负高压，Ri是分压电阻，流过各个倍增极分压电阻上的电流并不是相等的，阳极电流Ia最大，该电阻上的压降也最大，产生电压重分配效应，导致各个倍增极的分压随阳极电流的变化而变化，从而使PMT的增益发生改变。但是，当流过分压电阻的电流IR远大于Ia时，流过各个分压电阻IR的电流可以认为近似相等。因此，分压电阻阻值的选取应尽量小。

另一方面，分压电阻阻值越小，电阻功率损耗越大，越容易产生热效应，导致PMT温度升高、性能降低。综上，需要折衷考虑电阻的取值，本系统设计选用390 kΩ的电阻。当入射信号为快速变化的信号或脉冲信号时，会引起最后三级倍增极电流的剧烈变化，破坏PMT增益的稳定性。末三极分别并联一个电容，通过电容的充放电，使末三级电压保持相对稳定。

系统使用的高压供电模块是北京滨松光子公司的产品，型号为 CC228－01Y，输入电压 12 V，输出电压 0～－1250 V。通过控制电阻的调节，可以给PMT提供千伏以上的负高压。

1.3 转换电路设计

PMT的输出信号是电流信号，但是后续电路是基于电压信号而设计的，因此，首先需把电流信号转换为电压信号。通过串联一个负载电阻，实现信号的转换。如图3所示。

PMT 输出电流范围为 10－10～10－3A，近似当作恒流源。 如果负载电阻过大，将导致输出线性和频率响应的恶化。信号输出的截止频率fC为：

图3 电流－电压转换电路Fig.3 Current-voltage conversion circuit

式中RL是负载电阻，CS是负载电阻PMT阳极和其他电极之间的静电电容量，以及由于布线等引起的杂散电容量的总和。由上式可以看出，虽然PMT和放大器响应时间极快，输出响应也会受到截止频率的限制。如果负载电阻RL过大，在高输出电流的情况下，负载电阻RL将导致阳极电压降增大，导致阳极与末级倍增极电压降低，破坏输出线性性。负载电阻应采用温度系数较小的金属膜电阻，以减小温度漂移对测量结果的影响。PMT的信号输出部分选用低噪声同轴电缆线，降低噪声对关键信号的影响。

1.4 信号滤波与放大电路设计

经负载电阻RL后输出的电压信号为毫伏级别甚至更低，同时混有各种干扰信号，需要滤波处理并进一步放大，以满足后续数据采集的要求。运算放大器选择零点偏移小，无外部调零的器件。同时输入阻抗和开环放大倍数无穷大，保证输入端工作电流为0；输出阻抗无穷小，保证输出电压不随下级负载而变。系统选用TI公司的TLC272放大器芯片，该芯片的特点是低噪声、低失调电压、高输入阻抗，高响应速度，适用于微弱信号放大的场合。

图4 信号放大及倍率选择电路Fig.4 Amplifying and ratio selection circuit

系统设计了一个换挡开关，分4个倍率档位，以适应不同强度的荧光信号。每个档位分别由一个电阻和一个电容构成，放大倍数由电阻值决定。电容起积分作用，抑制或平滑高频噪声。电容值越大，抗干扰能力越强，但是会牺牲系统的响应速度，因此需要根据系统的需求，合理地选取C1～C4的值。

2 数据采集系统设计

本文采用美国国家仪器公司，型号为PCI－6251的数据采集卡进行数据采集。以Labview为平台构建虚拟仪器。实时监测信号特征。系统的信号变化范围为0～10 V。本文用于数据采集的子VI主要有：

DAQmx Create Channel.VI，创建虚拟通道，配置接线端的接线模式，设定输入的范围等。本文接线端采用差分输入模式，设定的输入范围为－0.1～10 V。差分输入模式有利于消除信号在传输过程中受到的大部分环境干扰。

DAQmx Timing.VI，设置采样时钟源以及时钟频率等信息。本文设定的采样模式是连续采样模式，每通道采样数参与定义循环缓冲的大小。数据的读取速度有限，可以适当增加每通道采样数以增大缓存，防止数据溢出。

DAQmx Read.VI，从指定的虚拟通道读取数据，读入的数据为荧光光强转换得到的电压值，模拟信号以波形的方式直观地显示。信号不可避免地会受到50 Hz工频干扰，以及其他系统高频干扰，因此有必要设置低通滤波器，截止频率为5 Hz。

设计的数据采集系统仪器面板如图5所示。仪器面板的左下部分为系统配置窗口，在开始采集之前首先进行通道设置，选择数据采集卡任一可用的模拟输入通道，然后设置采样率，每通道采样数以及采样模式等。启动程序，通过右侧部分的窗口对数据进行实时观测，上半部分是原始采样得到的数据，下半部分是滤除高频噪声后得到的比较稳定的数据，同时也可以在左下部分的窗口读取实时的电压值。或者将采样得到的数据写入测量文件，进行进一步的处理和分析。

图5 荧光强度检测系统仪器面板Fig.5 Instrument panel of the fluorescence intensity detection system

3 荧光检测实验结果与讨论

3.1 实验方法

选用已消毒的大白鼠，实验前禁食过夜但可自由饮水。实验前腹腔注射20%的乌来糖1 mL麻醉，剪去大鼠右侧腿部白毛，酒精消毒，找到股动脉分叉处，切开1 cm左右的小口露出股动脉。在自制支架上用绳索固定大鼠4只腿，调节光纤端口位置使与股动脉垂直并紧贴股动脉分叉处，然后固定。光源光纤端口平行对准大鼠腿部的另一侧，固定后打开激光光源。用5 mL注射器抽取2 mL 20%DMSO生理盐水配置的浓度为250μg/mL的CYPATE，通过大鼠尾静脉注射给药。给药后立即开始记录数据，每1 min记录一次荧光强度数据，记录到30 min时开始每5 min记录保存一次数据。整个操作过程除进行静脉注射其余全部在暗室中进行。

同样选用已消毒的大白鼠进行系统的评估实验。尾静脉注射2 mL浓度为 250μg/mL的 CYPATE，给药后分别于1，5，10，15，20，30，60，90 min 从眼眶取血 0.6 mL，4 000 rpm离心10 min后取血浆，置于2 mL EP管中于冰箱中保存。取完所有时间点后将每组装有血浆的EP管并排放置在CCD照相机下进行成像。荧光成像图如图6，1～8分别表示给药后1，5，10，15，20，30，60，90 min 得到的血浆荧光成像。

图6 不同时间点的血浆在近红外成像系统中的荧光成像图Fig.6 Plasma at different time points ofthe near-infrared imaging fluorescence imaging system

3.2 实验结果与讨论

与将设计的荧光检测系统在体监测的结果，经归一化后，与经过同样方式数据处理的体外监测结果进行比较，结果如图7所示。

图7 荧光检测系统和近红外成像系统检测结果比较Fig.7 Comparison of the detection results of fluorescence detection system and near-infrared imaging system

对比结果可以看出，这两种方法测得的时量曲线的下降幅度稍有不同，体外荧光检测显示静脉注射CYPATE 5 min后曲线下降幅度要略微大于在体监测得到的结果，这可能是由于血管中的CYPATE在5 min后向周围组织扩散，而股动脉相对较细，在体监测的接收光纤口不但接收了血管中的荧光强度，同时也接收了周边组织中散射过来的荧光，结果导致在体监测血管中的荧光强度要大于实际血流中的荧光强度，但是通过时量曲线的比较也可以看出这种影响的程度不大。

在持续工作的90 min内，荧光检测系统的检测结果，与现有成像系统的结果的变化趋势保持一致，证明本文设计的系统是有效的。60 min以后的曲线依然非常稳定，表明系统能够在较长时间内保持稳定的工作状态，满足在体荧光检测的要求。

为了将本设计运用于更微弱的荧光检测场合，还需要进一步改进检测电路，改进光纤探头的设计，提高检测灵敏度。本系统为后续的研究提供了有利条件。本文研究的微创光纤探头不仅可以作为荧光探测器，也可以作为激发信号的导入载体。因此，基于微创光纤探头的内窥式荧光检测系统设计，对于在体医疗器械的研究和开发，具有重要的价值。

4 结 论

本文以光电倍增管为核心探测器，使用高速数据采集卡进行数据采集，采用虚拟仪器技术，以Labview为信息处理平台，设计了基于微创光纤探头的内窥式荧光检测系统。该系统可实时反映生物组织或离体组织的荧光强度变化。通过在体实验验证，以及现有的荧光成像系统体外实验评估，可以初步认定，本文设计的荧光检测系统对于生物组织的荧光检测有着较高的灵敏度和精确度，并且能够完成在体的连续测量。

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