心绞痛贴膏穴位贴敷预处理对急性心肌梗死大鼠血清心肌酶及TNF-α、IL-6的影响*

王 帅 王凤荣

（辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

·研究报告·

心绞痛贴膏穴位贴敷预处理对急性心肌梗死大鼠血清心肌酶及TNF-α、IL-6的影响*

王 帅 王凤荣△

（辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

目的观察“心绞痛贴膏”穴位贴敷预处理对急性心梗大鼠的干预效应及可能的作用机制。方法健康Wistar大鼠55只随机分为正常组、模型组、对照组和治疗组，正常组 10只，模型组、对照组和治疗组每组15只。在清洁级实验室以普通饲料饲养。对照组于胸前区贴硝酸甘油贴膜0.3 mg，治疗组予心绞痛贴膏穴位贴敷于心俞、膻中、神阙、后三里穴（每穴0.1 g），每日1次，每穴1贴，维持4~6 h，疗程10 d。模型组、对照组、治疗组均每日2 mg/kg多点腹腔注射异丙肾上腺素（ISO）10 d。第10日于实验结束时，查各组大鼠心电图，以ST段明显上抬或下移为造模成功的初步判断标准，取腹主动脉光镜下观察心肌病理学形态，检测大鼠肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）的含量。结果病理结果显示，对照组和治疗组心肌细胞损伤坏死较模型组轻，但也可见少量断裂、缺损及空白区着色不均匀出现。模型组心肌细胞坏死严重。治疗组和对照组的心肌酶学水平、TNF-α、IL-6表达显著低于模型组（P＜0.01）。结论心绞痛贴膏穴位贴敷预处理能够减轻AMI大鼠心肌损伤坏死程度，并可能通过抑制大鼠TNF-α、IL-6的表达减少炎症细胞浸润，从而起到改善心肌缺血的作用。

心绞痛贴膏 急性心肌梗死 心肌酶学 肿瘤坏死因子 白介素6

急性心肌梗死（AMI）是严重威胁人类健康的心血管系统疾病的急危重症，其死亡率高，且常引发心力衰竭、心律失常等严重并发症，直接导致患者生存质量下降，经济负担显著增加。药物治疗、介入治疗、外科搭桥能迅速改善血供、缓解心绞痛发作，方法较为成熟。但中药穴位贴敷疗法做为一种冠心病急性心肌缺血辅助治疗方式，在临床中也得到了广泛认可和应用，是融合中医整体观念、经络腧穴理论，集中药的药理作用和穴位刺激为一体，是“内病外治”的具体体现。临床发现，中药心绞痛贴膏穴位贴敷具有良好的改善心绞痛的作用。因此，本研究主要通过观察心绞痛贴膏穴位贴敷预处理对AMI大鼠的干预作用，对其可能的作用机制进行初步探讨。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠55只，体质量（250±50）g，购自辽宁中医药大学实验动物中心。动物许可证号：SCXK-（军）2007-004。

1.2 动物分组 将健康Wistar大鼠55只按随机数字表法随机分为空白组、模型组、对照组和治疗组，正常组10只，模型组、对照组和治疗组每组15只。在清洁级实验室饲养，以普通饲料喂养10 d。

1.3 实验药物 心绞痛贴膏药物组成：川芎45 g，丹参45 g，薄荷脑25 g，麝香1.0 g，苏合香20 g，檀香8 g，小茴香15 g，冰片10 g，制乳香（灯芯制）20 g，制没药（灯芯制）20 g，香附20 g，延胡索20 g，生姜汁10 g。生姜汁为鲜姜直接榨汁过滤所得，每贴含生药量0.1 g，由辽宁中医药大学附属医院制剂室提供。硝酸甘油贴片（广州白云山制药股份有限公司生产），每贴含硝酸甘油5 mg。

1.4 主要试剂 荧光定量PCR引物购自TaKaRa宝生物工程有限公司；荧光RT-PCR试剂由北京全氏金生物技术有限公司提供；异丙肾上腺素从辽宁中医药大学附属医院购买；水合氯醛由辽宁中医药大学动物实验中心提供；透射电镜试剂2.5%戊二醛、1%锇酸、环氧树脂EPON812由中国医科大学实验中心提供；免疫组化一抗、二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.5 主要仪器及设备 JEM-100CX型透射电子显微镜 （日本电子公司），LKBⅤ型超薄切片机 （瑞典LKB公司）；石蜡切片机（莱卡），奥林巴斯BX51显微镜；贝克曼全自动生化仪（上海医用仪器设备厂）；心电图机（GE公司MAC1200ST）；精密轮转切片机，RM2135，德国LEICA；系统生物显微镜，BX50F4，日本OLYPUS；漂烘处理仪，ZMN-6802，常州市华利电子公司；电热恒温干燥箱，GZX-DH.400-S-Ⅱ，上海跃进医疗仪器厂；电热鼓风干燥箱，101-0A，天津泰斯特仪器有限公司；超纯水机，Milli-Q，美国MILLIPORE；电冰箱，BCD-205F，HAIER。

1.6 实验方法 模型组、对照组、治疗组均每日2 mg/kg多点腹腔注射异丙肾上腺素（ISO）10 d。第10日实验结束时，予3.3 mL/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉。将麻醉后大鼠仰位固定于鼠板上，将针状电极插入大鼠四肢皮下，以50 mm/s的走纸速度，灵敏度2记录Ⅱ导联的心电图，出现以下阳性为心肌缺血，表示造模成功：J点上升或下降≥0.1 mV；T波低平（下降＞50%）倒置；T波高耸超过同导联的R波的1/2；心律不齐、心动过速、早搏或其他心律失常。大鼠心电图改变具备以上条件之一者即可判断为心肌缺血阳性。对照组于胸前区贴硝酸甘油贴膜0.3 mg，治疗组于心俞、膻中、神阙、后三里穴贴敷心绞痛贴膏（每穴0.1 g）。贴敷时间为每日6 h，共10 d。第10日将各组存活动物用水合氯醛皮下注射麻醉（药量300 mg/kg），麻醉成功后查心电图，对各组动物从腹主动脉采血、取心脏。

1.7 观察指标 一般情况：每日观察动物进食和行为变化，定期称体质量。心电图检测：各组动物入组时及用药第10日将动物麻醉后查心电图，观察ST段抬高或下移水平及心律变化。光镜病理观察：实验结束时，予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取出腹主动脉，光镜下HE染色病理观察。免疫组化法测定肿瘤坏死因子（TNF）-α、白介素（IL-6）水平。

1.8 统计学处理 采用SPSS19.0统计学分析。计数资料以（±s）表示，各组间的均数比较采用单因素方差分析（One-Way Anoay），采用LSD法作组间的多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较 使用ISO后有部分动物陆续死亡，其中模型组死亡4只，对照组死亡3只，治疗组死亡2只。符合AMI死亡率高的特点。查心电图示ST段无变化的模型组1只，对照组1只，治疗组2只。心电图示心律失常的对照组1只，治疗组1只。剔除上述动物，只保留ST段明显上抬或下移的动物。

2.2 各组大鼠光镜病理结果正常组：心肌细胞排列紧凑规整，闰盘、横纹清晰，横纵切面形态结构一致，心肌细胞核位于心肌细胞中央，形态、大小正常，肌原纤维排列有序，无断裂及缺损，无空白区（见图1）。模型组：心肌细胞交织成网，看不到横纹，心肌细胞核、心肌纤维排列紊乱，可见断裂及缺失，心肌细胞核固缩，出现空白区，异染色质呈现团块状，相邻细胞闰盘间隙增宽（见图2）。对照组：心肌细胞排列较规整，可见到横纹，大部分心肌细胞核形态、大小基本正常，位于心肌细胞边缘，肌原纤维排列较有序，仍可见断裂、缺损及空白区着色不均匀（见图3）。治疗组：心肌细胞排列较规整，可见横纹，闰盘清晰，心肌细胞核仍固缩呈圆形，位于心肌细胞边缘，肌原纤维排列较有序，仍可见有断裂、缺损及空白区（见图4）。

图1 正常组（×10）

图2 模型组（×10）

图3 对照组（×10）

图4 治疗组（×10）

2.3 各组大鼠心肌酶学指标比较 见表1。模型组、对照组和治疗组肌酸肌酶（CK）水平均较正常组高，与正常组比较，有统计学意义（P＜0.01）。对照组和治疗组CK水平较模型组低（P＜0.01）；对照组和治疗组CK水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组、对照组肌酸肌酶同工酶 （CK-MB）水平较正常组高 （P＜0.01）。治疗组CK-MB水平较正常组高（P＜0.05）。对照组、治疗组CK-MB较模型组低 （P＜0.05或P＜0.01）；治疗组CK-MB水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组乳酶脱氢酶（LDH）水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠ST段抬高或下移水平、CK、CK-MB、LDH水平比较（±s）

表1 各组大鼠ST段抬高或下移水平、CK、CK-MB、LDH水平比较（±s）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别 n S T段抬高或下移（m V） C K（I U / L） C K -M B（I U / L） L D H（I U / L）正常组 1 0模型组 1 5对照组 1 5 0 ± 0 6 0 7 ± 3 4 7 . 5 2 3 3 1 0 . 9 0 ± 1 9 0 . 4 9 6 3 0 9 ± 1 9 3 . 1 1 9 0 . 4 5 ± 0 . 1 6**1 9 3 3 . 6 0 ± 4 0 4 . 3 5 4**9 3 5 . 6 0 ± 1 8 4 . 7 7 3**5 2 3 . 3 ± 1 3 8 . 9 9 6 0 . 1 7 ± 0 . 0 8**△△1 2 1 7 . 3 0 ± 3 7 9 . 4 6 7**△△6 8 2 . 1 0 ± 1 7 0 . 9 9 7*△5 1 5 . 1 ± 1 9 1 . 8 3 4治疗组 1 5 0 . 1 7 ± 0 . 0 9**△△1 1 8 4 . 1 0 ± 2 5 4 . 6 2 9**△△6 1 2 . 9 0 ± 1 7 0 . 7 6 7*△△5 3 1 . 7 ± 2 5 1 . 8 3 8

2.4 各组大鼠 TNF-α、IL-6积分光密度水平比较见表2，图5~12。模型组、对照组TNF-α较正常组高，对照组和治疗组TNF-α低于模型组（P＜0.05），治疗组低于对照组，两组比较有统计学意义（P＜0.05），治疗组与正常组比较无统计学意义。模型组、对照组、治疗组IL-6较正常组高（P＜0.05），对照组和治疗组IL-6低于模型组（P＜0.05），治疗组与对照组比较无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠TNF-α、IL-6积分光密度比较（pg/mL，±s）

表2 各组大鼠TNF-α、IL-6积分光密度比较（pg/mL，±s）

组别 n T N F -α I L -6正常组 1 0 8 . 6 2 3 7 ± 6 . 3 2 6 1 . 8 5 8 5 ± 1 . 7 8 8 1模型组 1 5 2 3 . 4 6 2 8 ± 1 . 0 2 2 6*4 . 8 2 7 9 ± 2 . 6 0 9 4*对照组 1 5 1 5 . 9 6 1 3 ± 1 . 3 4 8 5*△3 . 8 4 1 4 ± 1 . 9 1 9 5*△治疗组 1 5 8 . 1 5 8 7 ± 3 . 2 0 0 2*△3 . 6 3 1 7 ± 1 . 9 0 7 9*△

图5 正常组TNF-α（×20）

图6 模型组TNF-α（×20）

图7 对照组TNF-α（×20）

图8 治疗组TNF-α（×20）

图9 正常组IL-6（×20）

图10 模型组IL-6（×20）

图11 对照组IL-6（×20）

图12 治疗组IL-6（×20）

3 讨 论

穴位贴敷疗法是现代中药透皮给药的主要方式之一，药物借由经络的传输作用将有效成分输送且作用于所系脏腑，调节人体脏腑功能，达到预防和治疗疾病的目的，这也成为了“病在内者可取之于外”的理论基础。

本研究选取的心俞、膻中穴均为心、心包经俞募配穴，主治心痛、胸闷等心疾，为治疗心脏疾病的要穴；膻中为心包募穴，八会穴之气穴，利上焦、宽胸膈、降气通络主治胸闷、心痛等胸中气机不畅的病证。俞募相配，有疏通心、心包经气血作用，为治心之要穴；气海为肓之原穴，主治虚脱乏力等气虚之证；足三里为足阳明经之合穴，主治虚劳诸症。配合中药外敷，共奏活血化瘀，育阴潜阳、养心益气，通经活络之功。川芎为方中君药，辛香走窜而行气，活血祛瘀以止血，上行头目而祛风，下入血海以调经。丹参祛瘀止痛、清心除烦、养血安神；薄荷清利头目；麝香开窍醒神、活血散结；苏合香开窍、止痛；冰片通诸窍；乳香、没药用于一切气滞血瘀之痛证，诸药共奏活血止痛、温通心络、芳香开窍之功。现代研究亦证实，川芎中所含有的川芎嗪、阿魏酸钠可扩张冠状动脉，增进冠脉流量，能降低血小板表面活性，抑制血小板聚集，抗血栓形成，改善心脏微循环并降低心肌耗氧量。缓解心绞痛，并具有抗血栓形成作用。丹参能扩张冠状动脉，增加冠脉流量，减轻心肌缺血的损伤程度，加快心肌缺血损伤的恢复，缩小心肌梗死范围，降低血液黏稠度，抑制血小板聚集和黏附性，抗血栓形成。冰片具有抗菌、抗炎、镇痛作用，对AMI的麻醉犬产生与冠心苏合丸类似的作用，能使冠状窦血流量回升，减慢心率，降低心肌氧耗量，提示冰片有利于冠脉痉挛的防治，并可减轻缺血引起的心肌损伤。苏合香提取物能减慢心率、改善冠脉流量和降低心肌耗氧，抗血小板聚集。高社光等［1］观察到，麝香通痹膏贴敷膻中、内关穴对130例不同类型的冠心病心绞痛患者的心绞痛、心电图有明显改善作用。戴居云等［2］在65例冠心病患者中观察了丹参益心帖贴敷心俞、膻中等穴对心绞痛、心悸、胸闷、气短等临床症状和心电图的作用，并以硝酸甘油贴敷、口服复方丹参片作为对照，结果表明，上述药物穴位贴敷均可缓解心绞痛，改善上述临床症状和缺血性心电图。

冠状动脉粥样斑块破裂形成血栓是AMI的主要病理基础，虽然对动脉粥样硬化（AS）的病因及发病机制目前仍未完全阐明，但脂质代谢异常、内皮细胞损伤及其功能异常、血管平滑肌细胞增生、迁移和表型改变是AMI等AS产生的重要因素。本研究仅围绕AMI过程中的炎症机制，探讨心绞痛贴膏外治法防治AMI的作用机制。TNF-α是重要的炎性因子，TNF-α作为IL-6的上游激活物，诱导单核细胞产生IL-6，IL-6进一步参与炎症反应。IL-6不仅参与AMI后的炎症反应，还有强大的增加血小板作用，是促凝因子，而且直接影响C反应蛋白水平，加重炎症反应［3］。另外，TNF-α和IL-6还通过干预血管内皮细胞表型，使炎症细胞渗透到血管外，向受损心肌聚集［4］。本研究结果显示，治疗组和对照组CK、CK-MB水平较模型组低，提示心绞痛贴膏和硝酸甘油贴具有较好的降低CK、CK-MB作用，模型组TNF-α和IL-6较正常组高，符合AMI后TNF-α和IL-6的改变，对照组和治疗组TNF-α和IL-6低于模型组，且治疗组TNF-α低于对照组。研究表明，心绞痛贴膏与硝酸甘油贴改善AMI心肌酶学作用相近，但在降低TNF-α水平及抑制IL-6方面优于硝酸甘油贴，或作用与其相当，尤其以早期用药效果为佳。穴位贴敷防治急性心肌缺血的机理可能与抑制主动脉炎性因子的表达有关，至于局部穴位贴敷抑制动脉粥样硬化、降低血脂的具体作用机制还需要深入研究。

［1］ 高社光，康日新.麝香通痹膏穴位贴敷治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病心绞痛130例［J］.河北中医，1999，21（3）：136.

［2］ 戴居云，王子芳，李鼎.丹芪益心帖治疗冠心病心绞痛临床疗效观察［J］.中国针灸，1997，17（10）：588.

［3］ Souza JR，Oliveira RT，Blotta MH，et al.Serum levels of interl eukin-6（IL-6），int erleu kin-18 （IL-18）and C-reactive protein（CRP）in patient swith type-2 diabetes and acut ecoronary syndrome without ST-segment elevation［J］.Arq Bras Cardiol，2008，90（2）：86-90.

［4］ Min N，Paul L，Peter L.Inflammatory cy tokines and postmyocardial infarction remodeling［J］.Circ Res，2004，94：1543-1545.

Experimental Study on the Influence of Angina Pectoris Patch Acupoint Application Pretreatment on A-cute Myocardial Infarction in Rats in Serum Myocardial Enzyme，TNF-α，and IL-6

WANG Shuai，WANG Fengrong. Hospital Affiliated to Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning Shenyang 110032，China

Objectives：To discuss the effect of angina pectoris patch sticking preconditioning on acute myocardial infarction in rats and its possible mechanism.Methods：55 healthy Wistar rats were randomly divided into the normal group，model group，control group and treatment group，10 rats in the normal group，15 rats in the model group，control group and treatment group，fed with normal diet in a clean laboratory.The control group patched nitroglycerin 0.3 mg on the chest area，while the treatment group were treated with angina pectoris plaster acupoint application in Xinshu，Tanzhong，Shenque，after three points（each point 0.1 g），once a day，every point 1 sticker，maintaining 6 h.The treatment lasted for10 days.The model group，the control group，the treatment group received daily multipoint intraperitoneal injection of isoproterenol（ISO）2 mg/kg for 10 days.On the tenth day at the end of experiment，the ECG of the rat was examined，and the success of modeling was preliminary judged by ST segment elevation or depression，and the myocardial pathological morphology of abdominal aorta was observed under light microscope to observe，detecting the content of rat CK，CK-MB，LDH，TNF-alpha，IL-6.Results：The pathological results showed that myocardial cell damage and necrosis of the treatment group and the control group was lighter than that of the model group，but a small amount of fault was obvious，and defect and blank region coloring appeared.Myocardial cell necrosis in the Model group was serious.The myocardial enzyme levels of TNF-alpha，IL-6 of the treatment group and control group were significantly lower than those of the model group（P＜0.01）.Conclusion：Angina plaster acupoint application of pretreatment can reduce the degree of necrosis of myocardial injury in AMI rats，and may inhibit the TNF-alpha，the expression of IL-6 of the rat，reducing the infiltration of inflammatory cells，so as to improve myocardial ischemia.

Angina plaster；Acute myocardial infarction；Myocardial enzyme；Tumor necrosis factor；Interleukin 6

文献标志码： 文章编号：1004-745X（2015）06-0974-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.06.013

2015-03-20）

辽宁省科技计划项目（20100225034）

△通信作者（电子邮箱：wfr925@126.com）