Wnt信号通路中GSK-3β和CD44v6在人结直肠肿瘤组织中的表达及意义

吴红霞，郑绘霞，梁建芳(山西医科大学第二医院西院病理科，太原 03000;山西医科大学第一临床医学院病理科;通讯作者，E-mail:liangjianfang000@63．com)

Wnt信号通路异常激活在结直肠癌(colorectal cancer，CRC)中被确认为是与肿瘤相关的一个关键性信号通路，大约90%的结直肠癌存在Wnt信号通路的异常激活，Wnt信号通路过度激活也常引起肿瘤侵袭转移能力的增强［1，2］。GSK-3β 为 Wnt信号通路中重要的负向调节因素，黏附分子CD44v6是Wnt信号通路突出的靶基因，本文通过研究二者在结直肠癌中的表达情况，探讨GSK-3β及CD44v6在结直肠癌发生发展中的的作用及二者相互作用关系，为临床预后及治疗提供一定的依据。

1 材料与方法

1．1 临床资料

选择山西医科大学第二医院西院病理科2014-01～2015-07间的石蜡包埋标本，包括20例正常结直肠肠黏膜、19例结直肠腺瘤和45例结直肠腺癌。正常肠黏膜组均为距肿瘤大于5 cm的切缘正常组织，男性10例，女性10例，年龄22-82岁，中位数65岁。腺瘤组，男性12例，女性7例，年龄30-80岁，中位数50岁。结直肠腺癌组，男性21例，女性24例，年龄22-82岁，中位数66．5岁。所有入选病例术前均未做过放、化疗。所有标本重新切片，HE染色形态学符合结直肠腺瘤与腺癌的特点。

1．2 实验方法

采用免疫组织化学EnVision两步法，鼠抗人GSK-3β多克隆抗体试剂购自Santa cruz biotechnology，Inc，鼠抗人CD44v6单克隆抗体试剂购自北京中杉金桥生物科技有限公司，DAB显色试剂购自福州迈新生物技术有限公司，用已知阳性的切片作阳性对照，PBS液代替一抗作为阴性对照，实验步骤按试剂说明书进行。

1．3 免疫组化判定标准

GSK-3β以细胞胞质出现棕黄色颗粒为阳性，CD44v6阳性表达定位于胞膜。免疫组化判读:随机选择10个高倍镜(400倍)视野，每个视野计数100个细胞，以阳性细胞比率(无着色为0分，＜1/3为1分，1/3-2/3为2分，＞2/3为3分)与染色强度(无着色、黄色、棕黄和棕褐色分别为0，1，2，3分)的乘积综合判断，0-4分为阴性(-)，5-7分为阳性(+)，8-10分为强阳性(++)。

1．4 统计学分析

所有资料均采用SPSS11．5统计软件包进行分析，组间比较及各指标临床病理参数的比较采用χ2检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 GSK-3β在各组织中的表达情况

正常结直肠黏膜中GSK-3β表达阳性率5．0%(1/20)，腺瘤中 GSK-3β表达阳性率42．1%(8/19)，CRC中GSK-3β表达阳性率77．8%(35/45)。CRC组GSK-3β表达显著高于腺瘤组和正常黏膜组，差异有显著性(P ＜0．05，见表1)。

CRC组GSK-3β表达与Dukes分期、分化程度、有无淋巴结转移均无关(P＞0．05，见表2，图1)。

2．2 CD44v6在各组织中的表达情况

CD44v6在正常黏膜及腺瘤组织中均不表达，阳性率为0。在CRC中阳性率为55．6%(25/45，见图2)。CRC组CD44v6的表达显著高于腺瘤组和正常黏膜组，差异具有统计学意义(P＜0．05，见表1)。

在CRC组中，CD44v6的表达与Dukes分期、淋巴结转移相关(P＜0．05)，而与分化程度无关(P＞0．05，见表2，图2)。

表1 GSK-3β和CD44v6在结直肠正常黏膜、腺瘤及CRC中的表达 (例)Table 1 The expression of GSK-3β and CD44v6 protein in the normal intestinal mucosa，colorectal adenomas and colorectal carcinoma (cases)

图1 GSK-3β在结直肠腺癌、腺瘤及正常肠黏膜的表达 (EnVision，×200)Figure 1 GSK-3β protein expression in the colorectal carcinoma，colorectal adenomas and normal intestinal mucosa(EnVision method，×200)

表2 GSK-3β和CD44v6在CRC中的表达与临床病理参数的关系Table 2 Relationship of GSK-3β and CD44v6 protein expression with clinicopathological characteristics in colorectal carcinoma

图2 CD44v6在结直肠腺癌、腺瘤及正常肠黏膜的表达 (EnVision，×200)Figure 2 CD44v6 protein expression in colorectal carcinoma，colorectal adenomas and normal intestinal mucosa(EnVision method，×200)

2．3 GSK-3β和CD44v6在CRC中表达的相关性

GSK-3β与CD44v6在CRC中表达共同阳性21例，共同阴性6例，经Spearman秩相关分析二者表达无相关性(r=0．167，P ＞0．05，见表 3)。

表3 CD44v6和GSK-3β表达在CRC中的相关性分析Table 3 Correlation analysis of GSK-3β and CD44v6 protein expression in colorectal carcinoma

3 讨论

CRC是全球人类主要的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的健康。目前认为CRC发生的机制有四种:经腺瘤癌变通路，锯齿状病变通路，溃疡性结肠炎相关的大肠癌通路及幼年性息肉病-癌途径。其中经腺瘤癌变途径的散发性CRC多认为与Wnt信号通路异常激活有关。

糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是Wnt信号通路中重要的负向调节因子。GSK-3β是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，人类多种疾病如糖尿病、肿瘤、神经退行性疾病、情感障碍和炎症等疾病的发生都与GSK-3β活性调节异常有关，在许多肿瘤组织中呈高表达［3-5］。GSK-3β作为Wnt信号通路中 APC-β-catenin-GSK-3β-Axin多聚蛋白复合体的重要一份子，是Wnt信号通路的负向调节因素，可磷酸化β-catenin的丝氨酸和苏氨酸位点，促使βcatenin的降解;亦可经Axin磷酸化APC，磷酸化的APC会增加其与β-catenin的结合，继而降解β-catenin，从而使Wnt信号通路保持沉默。GSK-3β也可直接调节β-catenin目的基因cyclin D1的降解，影响细胞的增殖［6］。在我们研究的45例 CRC中，GSK-3β在三组病例中的表达，无论是阳性病例数还是强阳性病例数都是正常黏膜→腺瘤→癌显著增高，意味着GSK-3β参与正常黏膜→瘤变→癌变通路，参与了CRC的发生，影响细胞的增殖和分化。在食管癌中，GSK-3β在组织中的表达明显高于正常食管上皮及非典型增生病变，但与临床病理参数如肿瘤分级、浸润深度及淋巴结转移均无关［7］，但在子宫内膜癌中，GSK-3β在癌组织中的表达明显高于正常内膜组织，且与临床病理参数肿瘤分级、分期，肌层浸润程度及淋巴结转移相关，其过表达与子宫内膜癌的发生发展及转移密切相关［8］。

我们的研究显示，GSK-3β在CRC中表达与临床病理参数的Dukes分期、分化程度、淋巴结有无转移均不相关，表明GSK-3β在参与肿瘤细胞的增殖方面有一定的作用，但与肿瘤的浸润转移无明显相关性，即与肿瘤的恶性进展可能无多大关系，对评价患者的预后意义较小。

Wnt信号通路的过度激活常引起肿瘤侵袭转移能力的增强，黏附分子CD44作为Wnt信号通路上突出的靶基因，其过度表达是影响肿瘤转移的一个重要机制［9］。CD44是目前发现的五类细胞黏附分子之一(整合素、免疫球蛋白超基因家族、选择素、钙黏附素和CD44)，CD44基因的表达产物是一种细胞表面的跨膜糖蛋白，能与多种配体分子结合，参与细胞与细胞、细胞与基质之间特异性粘连。

CD44基因的外显子按表达方式分为两种类型:标准构型CD44s和变异型CD44v。CD44v6为CD44v亚型之一，在肺癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、宫颈癌、肾癌和非霍奇金淋巴瘤等多种肿瘤组织中均有显著高表达，并与恶性肿瘤进展程度、转移及预后密切相关［10］。在胃癌中的研究发现，CD44v6在组织中呈显著过表达，且与肿瘤的部位、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期均有关，并且是胃癌预后的重要标记物［11］。在乳腺癌中，CD44v6同样呈高表达，并且与肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期有关［12］。本研究通过检测不同结直肠组织中CD44v6的蛋白表达情况，发现在正常黏膜和结直肠腺瘤中其表达缺失，而在CRC组织中显著高表达，阳性率为55．6%，提示CD44v6可能在一定程度上参与了CRC的进程。Jurrit等［13］研究发现 C57BL/6J-CD44-/-APCMin/+小鼠肠腺瘤的形成较C57BL/6J-CD44+/+APCMin/+小鼠减少50%，暗示CD44参与了肠腺瘤的启动。本实验 CD44v6在腺瘤组织中表达缺失，提示CD44v6对人结直肠腺瘤的发生并无直接影响，可能是CD44的其他亚型参与该过程。本研究还发现CD44v6在CRC中的表达与肿瘤的大小及肿瘤细胞的分化程度不相关，而与淋巴结转移有关。23例有淋巴结转移的病例，17例检测到CD44v6阳性表达，阳性率高于无淋巴结转移的病例，由此可见，CD44v6的表达与肿瘤的转移相关联。Amirghofran等［14］研究表明，有淋巴结转移的 CRC患者血清CD44v6水平显著增高，并与肿瘤组织中的高表达呈正相关，表明CD44v6在CRC的浸润转移过程中发挥着重要作用，做为CRC预后检测的肿瘤标志物尚需更多实验来证实。

Wnt信号通路的持续异常激活，一方面导致GSK-3β的功能失活引起异常表达，最终引起细胞的增殖，CRC的形成;另一方面，通过激活Wnt信号特定靶基因CD44等的转录，调控细胞的迁移，而CD44v6 直接参与肿瘤的浸润转移过程［15，16］。经Spearman秩相关分析，GSK-3β和CD44v6在CRC中的表达并无显著相关性，提示二者可能作为Wnt通路上两个独立的调控因子分别参与CRC的发生发展。

由此可见，GSK-3β在正常黏膜、腺瘤及CRC中均有表达，并呈阶梯式增高趋势，但其表达与CRC各临床病理参数无关，提示其参与了结直肠肿瘤的发生，而与CRC的转移进展无关。CD44v6在正常黏膜及腺瘤中不表达，在CRC组织中呈高表达，并与淋巴结转移密切相关，意味着CD44v6并不参与结直肠肿瘤的发生，而与CRC的转移进展有关。当然，由于本研究例数的限制，可能对实验结果造成误差，目前还在收集病例及新鲜标本做进一步的研究，希望能对二者在结直肠癌中的表达进行更深入的研究，为结直肠癌的预后及靶向治疗提供一定的依据。

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