内毒素耐受对细胞因子的影响

（中国医科大学附属第四医院风湿免疫科，沈阳 110032）

内毒素耐受对细胞因子的影响

赵欣欣，闵睿，张丽丽

（中国医科大学附属第四医院风湿免疫科，沈阳 110032）

目的进一步明确内毒素耐受时炎性相关细胞因子的变化。方法昆明鼠分组处置。建立内毒素（LPS）耐受鼠模型。ELISA方法测定血清肿瘤坏死因子α（TNF-α），白细胞介素10（IL-10）和白细胞介素17（IL-17）浓度。结果LPS对照组血清TNF-α、IL-10和IL-17浓度分别为（2 261.49±1 090.28）pg/mL，（7 780.42±2 320.04）pg/mL，（27.28±13.76）pg/mL，较健康对照组显著增高。而内毒素耐受组相应细胞因子血清浓度分别为（1 174.19±450.91）pg/mL，（1 293.26±520.85）pg/mL，（22.26±11.44）pg/mL。地塞米松干预进一步降低了TNF-α和IL-17的水平，但对IL-10水平无显著影响。结论内毒素耐受状态与内毒素炎症状态比较，TNF-α和IL-10水平显著降低，IL-17水平无显著变化。应用地塞米松可进一步降低内毒素耐受状态下的TNF-α和IL-17水平。

内毒素耐受；肿瘤坏死因子α；白细胞介素10；白细胞介素17

内毒素也称为脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性菌菌壁的主要成分，在人体内LPS通过作用于Toll样受体4激活核因子κB，使机体产生显著的炎性反应，多种促炎细胞因子升高，如肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、IL-8、干扰素等，同时还伴随多种抗炎介质，如IL-10、转化生长因子β、糖皮质激素的升高，严重时可出现系统性炎性反应综合征、多器官功能障碍综合征而危及生命。然而，如预先予机体小剂量的LPS刺激，机体对随后大剂量或致死量LPS刺激呈现出低反应甚至无反应的现象，这种现象称为内毒素耐受。内毒素耐受的形成避免了机体产生持续过度的炎性反应，对机体是一种保护作用。内毒素耐受的发生机制尚未完全清楚。目前认为LPS主要作用于单核/巨噬细胞，诱发炎性反应或内毒素耐受均主要通过单核/巨噬细胞系统产生，标志性事件是炎症时TNF-α水平显著升高，而内毒素耐受时TNF-α升高水平显著下降［1］。IL-17也是重要的促炎因子，在慢性炎症和自身免疫性炎症中发挥重要作用。内毒素耐受时，炎症表现明显受抑，是否也影响IL-17的产生值得研究。到目前为止，尚未见相关研究报道。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：8～12周龄雌性昆明小鼠，体质量26～38 g，购于中国医科大学实验动物中心，SPF级，饲养于中国医科大学附属第四医院动物室独立通风笼具系统，标准灭菌复合饲料及纯净水饲养，室内自然温度及光照。主要试剂：脂多糖（O55：B5）购于宝信生物公司；TNF-α酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、IL-10 ELISA试剂盒和IL-17 ELISA试剂盒均购于博士德公司。

1.2 昆明小鼠分组

Ⅰ组：健康对照组（10只）；Ⅱ组：LPS阳性对照组（10只）；Ⅲ组：内毒素耐受组（6只）；Ⅳ组：高剂量地塞米松干预内毒素耐受组（6只）；Ⅴ组：低剂量地塞米松干预内毒素耐受组（6只）。

1.3 分组处置

Ⅰ组小鼠连续5 d腹腔注射0.9%氯化钠注射液（0.5 mL/d）。Ⅱ组小鼠连续4 d腹腔注射0.9%氯化钠注射液（0.5 mL/d），第5天腹腔注射大剂量LPS（8 mg/kg）。Ⅲ组小鼠连续4 d腹腔注射小剂量LPS（80 μg/kg·d），第5天腹腔注射大剂量LPS（8 mg/ kg）。Ⅳ组小鼠连续4 d腹腔注射小剂量LPS（80 μg/ kg·d），第5天腹腔注射大剂量LPS（8 mg/kg），注射大剂量LPS前1 h腹腔注射地塞米松（10 mg/kg）。Ⅴ组小鼠连续4 d腹腔注射小剂量LPS（80 μg/kg· d），第5天腹腔注射大剂量LPS（8 mg/kg），注射大剂量LPS前1 h腹腔注射地塞米松（1 mg/kg）。各组于第5天注射大剂量LPS 3 h后，采用摘眼球法取血标本，留取血清，4℃保存，次日检测血清细胞因子。

1.4 细胞因子水平测定

取血清标本，依照ELISA试剂盒内说明具体操作，检测OD值，应用curve exert1.3软件求得TNF-α、IL-10和IL-17浓度值。

1.5 统计学分析

正态分布数据2组间比较采用独立样本t检验，非正态分布数据2组间比较采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。应用GraphPad6绘制散点图。

2 结果

血清TNF-α水平（图1）：健康对照组（Ⅰ组）血清TNF-α浓度处于非常低的水平，LPS阳性对照组（Ⅱ组）TNF-α水平呈爆发式升高，2组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。内毒素耐受组（Ⅲ组）较Ⅱ组TNF-α水平显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），证明内毒素耐受诱导成功，但其水平仍高于Ⅰ组。地塞米松干预内毒素耐受组（Ⅳ组和Ⅴ组）TNF-α水平低于Ⅲ组TNF-α水平，差异有统计学意义（P＜0.01和P＜0.05）。

图1 各组血清TNF-α水平Fig.1 Serum TNF-α levels in different groups

血清IL-10水平（图2）：Ⅰ组血清IL-10浓度处于非常低的水平，Ⅱ组IL-10水平亦呈爆发式升高，两组比较P＜0.01，差异有统计学意义。Ⅲ组较Ⅱ组IL-10水平显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。Ⅳ组IL-10水平较Ⅲ组IL-10水平增高，差异无统计学意义，Ⅴ组IL-10水平较Ⅲ组IL-10水平降低，差异不具有统计学意义。

图2 各组血清IL-10水平Fig.2 Serum IL-10 levels in different groups

血清IL-17水平（图3）：Ⅰ组血清IL-17浓度处于较低的水平，Ⅱ组IL-17水平较Ⅰ组增高，差异有统计学意义（P＜0.01），但IL-17水平升高幅度（不足3倍）不如TNF-α和IL-10水平升高的幅度。Ⅲ组IL-17水平较Ⅱ组仅轻度下降，差异无统计学意义。Ⅳ、Ⅴ组与Ⅲ组比较，IL-17水平均下降，差异有统计学意义（P均＜0.01）。

3 讨论

图3 各组血清IL-17水平Fig.3 Serum IL-17 levels in different groups

机体初次受到中小剂量LPS刺激时TNF-α水平显著升高，形成内毒素耐受时TNF-α升高幅度明显降低，TNF-α的这种变化特点被认为是形成内毒素耐受的标志。本实验同样证实了，当小鼠单次受到LPS刺激时TNF-α水平显著升高，多次小剂量LPS刺激后，当小鼠受到大剂量LPS刺激后TNF-α升高幅度明显下降。许多研究表明内毒素耐受的主要环节是单个核细胞的功能发生了显著的变化［1］，有研究者称其为“重程序化（reprogramming）”［2］。而TNF-α主要是由活化的单个核细胞产生的。因而内毒素耐受表明单个核细胞系统的致炎功能被抑制。LPS可诱导体外培养的外周血单个核细胞产生内毒素耐受，进一步印证了上述观点［3］。

IL-10是一种多效性免疫调节细胞因子，具有保护机体免于感染相关性免疫病理损伤的作用，固有免疫和获得性免疫中的大部分细胞能够表达IL-10。IL-10缺乏鼠表现出的针对抗原的免疫反应程度加重且反应时间延长，机体出现过度的炎性反应。IL-10缺乏鼠针对LPS的发热反应也表现为程度加重和时间延长。依赖于IL-10的负反馈在防止由于T细胞介导的自身免疫病和感染诱发的免疫病理性组织损害中具有重要作用［4］。本实验中，LPS阳性对照组小鼠在单次大剂量LPS刺激后，在TNF-α显著升高的同时也伴随IL-10的显著升高，说明LPS诱发炎性反应的同时也开启了炎症的负反馈机制。但在内毒素耐受状态下，IL-10也随TNF-α水平降低而降低。小鼠内毒素耐受对细胞因子影响的研究结果表明TNF-α、IL-6和IL-10的产生在免疫耐受状态下均受到抑制，与本实验结果相近［5］。体外单个核细胞培养诱导的内毒素耐受也同样表现为TNF-α和IL-10水平降低［3］。说明IL-10对炎症的负反馈机制并不是内毒素耐受的产生机制。IL-10基因敲除鼠仍能发生内毒素耐受更加有力的说明IL-10不是内毒素耐受产生的责任细胞因子［6］。

无论体内实验还是体外实验都表明LPS诱导的炎性反应不仅引起TNF-α水平的升高，还可引起IL-17水平的升高。IL-17参与许多慢性炎性反应的发生，也与自身免疫状态具有很强的关联性［7］。本实验中，内毒素耐受在降低了以TNF-α促炎因子为代表的炎性反应的同时，也降低了以IL-10为代表的抑炎因子的负反馈反应，但对IL-17水平无显著影响。Rachmawati等［8］在模拟的内毒素耐受实验中，以一种抗TLR4单克隆抗体预刺激TLR4，产生了LPS耐受的现象，单核/巨噬细胞的功能受到抑制，但辅助性CD4+T细胞的活性并未受损。Th17细胞也来源于辅助性CD4+T细胞，故此推测其产生IL-17的能力也未受损。这可能是本实验中内毒素耐受未对IL-17水平产生显著影响的机制。

糖皮质激素具有抑制IL-17的作用［9］，但在内毒素耐受过程中，这一作用是否受到影响，尚未见报道。本实验中，对地塞米松干预内毒素耐受组，预先应用糖皮质激素-地塞米松后再使用大剂量LPS注射，则TNF-α和IL-17水平较未用地塞米松的内毒素耐受组显著下降，提示内毒素耐受状态下的免疫细胞仍具有对糖皮质激素的反应能力。糖皮质激素可能与内毒素耐受具有协同抑炎作用，能更广泛的抑制炎性反应，既能抑制固有免疫功能，又能抑制TH17细胞的功能。

内毒素耐受对IL-17是否存在影响，尚未见相关研究报道。本研究初步表明内毒素耐受对IL-17水平无显著影响，但预先给予地塞米松作用后，内毒素耐受小鼠的IL-17产生受到显著抑制。

综上所述，内毒素耐受状态与内毒素炎症状态比较，TNF-α和IL-10水平显著降低，IL-17水平无显著变化。应用地塞米松可进一步降低内毒素耐受状态下的TNF-α和IL-17水平，但对IL-10水平无进一步的显著影响。这一结果进一步说明了内毒素耐受主要发生在炎性反应的单核/巨噬细胞环节，而对淋巴细胞参与的以IL-17为标志的炎性反应环节影响不显著。

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（编辑裘孝琦）

EffectofEndotoxin Tolerance on Cytokine

ZHAOXin-xin，MINRui，ZHANGLi-li
（DepartmentofRheumatology，The Fourth Affiliated Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo further determine the inflammation-associated cytokine changes during endotoxin（LPS）tolerance.MethodsKunming mice were divided into groups.The endotoxin tolerance mouse model was established with repeated injection of LPS.Serum levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-10（IL-10）and IL-17 were determined by ELISA assay.ResultsThe serum concentrations of TNF-α，IL-10 and IL-17 were 2 261.49±1 090.28 pg/mL，7 780.42±2 320.04 pg/mL，and 27.28±13.76 pg/mL in the LPS control group，which were increased significantly compared to the normal healthy control group.The serum concentrations of TNF-α，IL-10 and IL-17 were 1 174.19±450.91 pg/mL，1 293.26±520.85 pg/mL，and 22.26±11.44 pg/mL in the endotoxin tolerance group.Levels ofTNF-αand IL-17 were furtherdecreased by dexamethasone treatment during LPS tolerance inducing，while the IL-10 level did not change significantly.ConclusionCompared to the status of endotoxin inflammation，levels ofTNF-αand IL-10 decreased significantly，while levels ofIL-17 were notsignificantly changed in the status ofendotoxin tolerance.Dexamethasone could furthersuppress TNF-αand IL-17 levels during endotoxin tolerance inducing.

endotoxin tolerance；tumor necrosis factor-α；interleukin-10；interleukin-17

R392

A

0258-4646（2015）03-0259-04

赵欣欣（1968-）男，副主任医师，博士. E-mail：cellcept@sohu.com

2014-09-18

网络出版时间：