超高效液相色谱－串联质谱法测定水果中乙撑硫脲残留

叶孟亮，聂继云，徐国锋，闫 震，郑丽静，李志霞

(中国农业科学院果树研究所，农业部果品质量安全风险评估实验室(兴城)，农业部果品及苗木质量监督检验测试中心(兴城)，辽宁 兴城 125100)

随着经济的发展和生活水平的提高，人们对果品质量安全的要求也越来越高。农药残留是果品质量安全中比较敏感且备受关注的话题。二硫代氨基甲酸盐(酯)类(DTCs)杀菌剂(如代森锰锌、代森锌、丙森锌、福美双等)因具有高效、广谱杀菌的效果而在水果生产中广泛使用［1－2］，其主要代谢物为乙撑硫脲。国际癌症研究机构(IARC)评估乙撑硫脲仅对动物存在致癌作用［3－4］，但食用含有乙撑硫脲残留的水果是否会对人体健康产生危害，已引起公众关注［5－6］。准确高效的检测方法是开展乙撑硫脲残留风险监测与评估的基础。目前关于乙撑硫脲残留的检测方法有气相色谱法［7－10］、高效液相色谱法［3，11－12］、液相色谱－串联质谱法［13－16］等，但这些方法存在前处理复杂、溶剂消耗量大、耗时、繁琐、检出限高、回收率偏低等不足，限制了其应用，因此建立快速、准确的测定水果中乙撑硫脲残留的分析方法具有重要意义。

本文在前人研究的基础之上，对乙撑硫脲的检测方法进行了筛选和优化，建立了快速、准确、高效测定水果中乙撑硫脲残留的检测方法。采用碱性乙腈(1.5%氨水乙腈)两次提取，弗罗里硅土进行净化，利用超高效液相色谱－串联质谱(UPLC－MS/MS)在多反应监测模式下进行检测。该方法有效去除了干扰，提高了灵敏度，定性与定量准确，能够很好地满足水果中乙撑硫脲残留的快速检测和确证要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱－串联质谱仪(UPLC－MS/MS Xevo TQ，美国Waters公司);立式大容量高速离心机(日本Hitachi公司);Milli-Q全自动超纯水制水机(美国Millipore公司)。

甲醇、乙腈、甲酸铵、乙酸铵、甲酸、乙酸、氨水(色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司);C18(ODS，50 μm，60)、石墨炭黑粉(GCB，Agela Technologies Inc);中性氧化铝(Alumina－N)、弗罗里硅土(Florisil，200 μm，100 g)、PSA(40 μm，100 g)均购于美国Varian公司;无水MgSO4(优级纯，天津市津科精细化工研究所);NaCl(优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司);实验用水为超纯水。

乙撑硫脲(ETU)标准品(CAS No.96－45－7，德国Sigma－Aldrich公司)，0.25 g，纯度≥99%。

1.2 标准溶液的配制

准确称取ETU标准品0.01 g于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配成1 000 mg/L的储备液，置于－20℃冰箱保存。准确移取适量标准储备液，按照梯度稀释的原则，配成5，20，50，100，200 μg/L的ETU标准工作液系列。标准工作溶液现用现配。

1.3 样品前处理

准确称取5 g匀浆样品于50 mL具塞离心管中，加入5 mL提取液(1.5%氨水乙腈)，摇匀2 min，静置10 min，9 000 r/min离心3 min，将上清液转移至另一支离心管中，再向残渣中加入5 mL提取液，重复以上操作，合并两次上清液，加入1 g氯化钠、2 g无水硫酸镁，振荡混匀2 min，9 000 r/min离心3 min，吸取上层有机相1 mL于10 mL离心管中，加入0.05 g弗罗里硅土，涡旋振荡1 min，静置2 min，上清液过0.22 μm有机系滤膜，待测。

1.4 UPLC－MS/MS条件

1.4.1 超高效液相色谱条件 HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国Waters公司);柱温:40℃;流动相:A为乙腈，B为0.2%甲酸水溶液;梯度洗脱程序:0～2 min，5%～95%A;2～4 min，95%～5%A;4～5.5 min，5%A;流速:0.4 mL/min;进样体积:5 μL。

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI);扫描方式:正离子模式;毛细管电压:3.0 kV;检测方式:MRM(多反应监测);离子源温度:150℃;去溶剂气温度:350℃;去溶剂气和锥孔气均为高纯氮气，流速分别为650 L/h和50 L/h;碰撞气:高纯氩气，流速0.14 mL/min。质谱参数:锥孔电压30 V，定量离子对m/z 103/44.1，碰撞能量16 V;定性离子对m/z 103/86，碰撞能量14 V。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理的优化

2.1.1 提取溶剂的优化 乙撑硫脲的提取溶剂主要有乙腈［6，16］、甲醇［5，15，17－18］。本研究以苹果为例，考察了这两种提取溶剂对乙撑硫脲的回收率。结果表明，以乙腈作为提取溶剂时，乙撑硫脲的回收率在50%左右，比甲醇作为提取溶剂时的回收率高10%，但回收率仍较低。Ekman等［6］的研究表明，碱性环境可以提高乙撑硫脲在乙腈中的溶解性，二者存在共轭效应，且乙撑硫脲在pH 5.0～9.0的环境下较稳定［16］。因此，实验尝试在乙腈中添加适量氨水(0.5%，1.0%，1.5%和2.0%)，考察提取液pH值对乙撑硫脲回收率的影响。结果表明，1.5%氨水乙腈(pH 8.7)的提取效果最好，加标回收率达90%以上，因此最终选择1.5%氨水乙腈作为提取溶剂(图1)。

2.1.2 净化剂的优化 本研究以较复杂的柑橘和含色素较丰富的葡萄为例，采用分散固相萃取即 QuEChERS 方法［19－20］，考察了 ODS、PSA、GCB、Alumina－N和Florisil 5种净化剂对水果中色素、有机酸、脂肪等杂质的净化效果以及对乙撑硫脲回收率的影响(见表1)。结果发现，除了ODS、Alumina－N对色素的吸附效果较差外(溶液颜色较深)，其余3种净化剂的净化效果均良好;而经GCB净化后，葡萄中乙撑硫脲的回收率偏低，为75.2%;经PSA净化后目标信号附近有杂峰干扰。因此，综合回收率、目标信号峰形、试剂成本等方面，最终选用Florisil为净化剂。

图1 不同浓度的氨水乙腈对苹果中乙撑硫脲回收率的影响Fig.1 Effect of different concentrations of acetonitrile and ammonia solution on recovery of ETU in apple

表1 经不同净化剂吸附后乙撑硫脲的回收率Table 1 Recovery of ETU absorbed by different cleaning agents

2.2 色谱条件的优化

流动相中缓冲盐的类型和离子强度对目标离子的色谱保留时间及质谱电喷雾离子的电离程度均有影响。甲酸、乙酸、甲酸铵和乙酸铵具有高挥发性和高溶解性，常用作液相色谱－串联质谱分析的缓冲盐。对比了乙腈－甲酸、乙腈－乙酸、乙腈－甲酸铵和乙腈－乙酸铵4种流动相体系对乙撑硫脲峰形及响应值的影响。结果表明，以乙腈－甲酸作为流动相时，乙撑硫脲的峰形较好，响应值较高(图2)。为达到更高的检测灵敏度，本研究进一步对甲酸浓度(0.05%，0.1%，0.2%和0.3%)进行优化。结果表明，当甲酸浓度为0.2%时，乙撑硫脲的信号响应值最高;当浓度超过0.2%后，乙撑硫脲的响应值反而下降，原因在于离子源中离子浓度过高时会抑制待测组分的电离，从而导致离子化效率下降［21］。因此，实验确定以乙腈－0.2%甲酸作为最佳流动相。

图2 4种不同流动相条件下乙撑硫脲的总离子流色谱图Fig.2 TIC chromatograms of ETU with four different kinds of mobile phase conditions

2.3 基质效应

基质效应(Matrix effects)是指色谱分离时共洗脱的物质改变了目标分析物的离子化效率，从而引起信号的抑制或增强［22］。基质效应影响大时将降低方法的灵敏度和准确性，进而影响仪器定性及定量分析。关于液相色谱－串联质谱分析中的基质效应已有大量研究，通常认为色谱分离过程中共流出物质对目标组分的响应值有很大影响［23］。共流出物质主要指样品前处理后仍保留在待测样液中的各类有机物(如脂肪酸类、糖类、色素等)［18］。选取苹果、桃、葡萄、柑橘和香蕉5种代表性水果进行研究，考察了乙撑硫脲在不同水果中的基质效应。分别筛选出不含乙撑硫脲残留的5种水果作为空白基质，用溶剂标准样液和5种水果空白基质匹配标准样液，在相同前处理和色谱条件下分别进样，按照公式Matrix effect(Me)=(A－B)/B×100%(A:基质匹配标准样液响应值，B:溶剂标准样液响应值)计算乙撑硫脲在不同水果中的基质效应［20］。结果表明，乙撑硫脲在5种水果中均表现出基质减弱效应，且在柑橘和香蕉中的基质减弱效应较大(表2)。这可能是由不同水果中有机酸和果胶的含量不同所致［23］。按照农药残留检测结果相对偏差不超过10%的要求［24］，当Me的绝对值大于10%时，即判定为有基质效应。因此，为保证方法的准确性和实用性，本研究采用基质匹配标准样液对基质效应进行补偿。

表2 乙撑硫脲在不同水果样品中的基质效应Table 2 Matrix effects of ETU in different fruits

2.4 线性方程、相关系数、检出限与定量下限

用不同水果空白基质分别配制5，20，50，100，200 μg/L质量浓度的基质匹配标准溶液。以乙撑硫脲的峰面积(y)对相应的质量浓度(x，μg/L)进行线性回归，结果表明，乙撑硫脲在5～200 μg/L范围内线性良好，相关系数均大于0.999。以3倍信噪比(S/N=3)计算方法的检出限(LOD)，以S/N=10计算方法的定量下限(LOQ)。5种水果基质中乙撑硫脲的LOD为0.08～0.26 μg/L，LOQ为0.28～0.86 μg/L(表3)，均远低于国家标准规定的残留限量(目前国内尚未制定水果中乙撑硫脲最大残留限量值，按照欧洲国家规定的植物性食品中乙撑硫脲的最大残留限量为50 μg/L计［8］)，方法的灵敏度可满足农药残留检测的要求。

表3 乙撑硫脲在不同水果样品中的标准方程、相关系数、检出限及定量下限Table 3 Standard regression equations，correlation coefficients(r)，LODs and LOQs of ETU obtained from different fruits

2.5 回收率与相对标准偏差

分别对5种不同水果基质进行5，20，50 μg/L 3个加标水平的回收率实验。按照本方法进行提取、净化及测定，结果见表4。经基质匹配标准样液校正后，乙撑硫脲在5种水果中的平均回收率为79.5%～101.4%，相对标准偏差(RSD)为2.7%～9.4%，表明该方法具有良好的准确度和精密度，完全满足水果中乙撑硫脲残留分析的要求。

表4 乙撑硫脲在不同水果样品中的加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 4 Recoveries and RSDs of ETU obtained from different fruits(n=6)

2.6 实际样品的测定

采用本方法对当地农贸市场购买的苹果、桃、葡萄、柑橘、香蕉5种水果各5个共25个样品进行检测。结果显示，11个水果样品(其中苹果4个，桃3个，葡萄3个，柑橘1个)中检出乙撑硫脲残留，检出率为44%，残留量为0.36～5.74 μg/L。阳性苹果样品的色谱图见图3。

3 结论

本文建立了水果中乙撑硫脲残留的液相色谱－串联质谱检测方法，采用1.5%氨水乙腈两次提取，弗罗里硅土净化后，超高效液相色谱－串联质谱仪(UPLC－MS/MS)多反应监测模式检测，方法的灵敏度、准确度和精密度均满足国家规定的要求［25］，可用于水果中乙撑硫脲残留的快速检测和确证分析。

图3 苹果中乙撑硫脲残留的总离子流色谱图Fig.3 TIC chromatogram of ETU residue in an apple sample

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