基于邻苯二甲醛－NH3－Na2SO3反应的固相荧光分析方法测定水样中的氨氮

严春梅，刘 鑫，梁 英，殷世民

(桂林电子科技大学 生命与环境科学学院，广西 桂林 541004)

固相荧光光谱法因操作简单、灵敏度高等特点受到广泛关注［1］。1977年Heller等首次采用固相荧光光谱法测定了低浓度的三硝基甲苯(TNT)［2］。20世纪90年代以来，Muller等［3］用三维固相荧光光谱法表征了固体废物的成分;Yang等［4］以尼龙膜作为支撑材料，建立了简单、高灵敏的2-萘磺酸固相荧光检测法，为降低2-萘磺酸对人类和环境的危害做出了贡献。del Olmo等［5］建立了用于测定水样中痕量西维因的新型固相荧光系统，该系统利用脉冲氮激光作为激发光源，以一种电荷耦合器件作为检测器，将自然水域中的西维因转化为1-萘酚进行测定。Alves等［6］用固相分子荧光法测定药物中的乙酰水杨酸、乙酰氨基酚和咖啡因;Huang等［7］将复合分子印迹聚合物膜(CIP)与固相荧光光谱法结合，测定了水样中的L-苯丙氨酸，该方法无需进行洗脱操作，简单、选择性好、实验成本低。同时，他们还运用铽(Ⅲ)水杨酸印迹膜(CIM)结合固相荧光光谱法快速分离和检测了药物和人体尿液中的水杨酸，避免了基底荧光对荧光法测定水杨酸的影响，建立了一种简单、高效、快速、低成本的固相荧光光谱法［8］。Hu等［9］将复合分子印迹聚合物膜(CIP)与固相荧光光谱法结合，用于测定生物样品中的槲皮素，方法选择性强、成本低、测定快速。由此可见，经过几十年的发展，固相荧光光谱法已被广泛应用于环境［3－5］、医学［6－8］、生物［9］等领域，具有简单、高效等优点，但目前尚未见用于氨氮测定的文献报道。

图1 反应机理Fig.1 Reaction mechanism of proposed method

1 实验部分

1.1 试剂与溶液

实验所用化学药品均为分析纯(阿拉丁公司)，有特别说明的药品除外。实验用水为电阻率大于18.2 MΩ·cm的超纯水。氨氮标准溶液:将于110℃干燥至恒重的(NH4)2SO4，配制成氨氮浓度为20 mmol/L的氨氮标准储备液，于4℃冷藏保存，使用时稀释成氨氮浓度为0.10 mmol/L的氨氮标准使用液，当天配制;不同浓度的氨氮标准工作溶液用0.10 mmol/L的氨氮标准使用液稀释得到。10.6 g/L邻苯二甲醛溶液:称取2.65 g OPA，溶于50 mL甲醇(色谱纯，阿拉丁)，再用水稀释至250 mL，摇匀密封避光冷藏保存。2.50 g/L Na2SO3溶液:称取1.25 g无水Na2SO3固体，溶于500 mL水后，向其中加入0.20 mL甲醛溶液(防止亚硫酸钠溶液变质)，摇匀后冷藏保存。OPA－Na2SO3混合溶液:将一定体积的10.6 g/L OPA溶液和2.50 g/L Na2SO3溶液混合稀释而成，溶液中OPA和Na2SO3的浓度分别为0.795 g/L和0.250 g/L。EDTA－NaOH缓冲溶液:称取26.0 g EDTA二钠和10.0 g NaOH溶于500 mL水中配制而成。

1.2 实验方法

将中速定量滤纸裁剪成3.5 cm×3.5 cm的正方形小滤纸片(每张滤纸片必须保证无污损，可置于聚乙烯塑料袋中密封长期保存)，置于适量(以完全浸泡滤纸为宜)OPA－Na2SO3混合溶液中浸泡至少4 h，使滤纸充分吸收混合溶液中的反应试剂OPA和Na2SO3，待用。为减少误差，同一条曲线上各点测定必须使用当天同一批制备的滤纸;测定样品时，工作曲线和样品测定必须使用当天同一批制备的滤纸。

图2 自制反应瓶Fig.2 Self-made reaction bottle

分别取50 mL不同浓度(2.00～12.0 μmol/L)的氨氮标准工作溶液或水样于500 mL自制反应瓶中(如图2)，从OPA－Na2SO3混合浸泡液中取出滤纸片置于反应瓶中的白色塑料支架上，加入4.0 mL EDTA－NaOH缓冲溶液至反应液中，控制反应液的pH值为11.5～13.0，盖好瓶盖，缓慢摇匀反应液，室温放置165 min，使反应液中逸出的氨气与滤纸片上的OPA与Na2SO3充分反应生成荧光物质，用镊子取出滤纸，迅速置于固相荧光测定支架上，设置仪器的激发和发射狭缝宽度均为3.0 nm，激发和发射波长分别为368 nm和426 nm，用RF－5301PC型荧光分光光度计(岛津公司)测定滤纸上荧光物质的荧光强度。为减小固相载体不均匀性带来的测定误差，对同一个滤纸样品，通过移动滤纸在测定支架上的位置使激发光照射在滤纸的不同位置，测得5个不同点的荧光值(图3)，取其平均值为该样品的荧光测定值(IF)，根据荧光测定值与反应液中氨氮浓度的关系确定样品中的氨氮浓度。

图3 滤纸荧光值测定点示意图Fig.3 Measuring points in a filter paper

2 结果与讨论

2.1 激发光谱与荧光光谱

配制浓度为12.0 μmol/L的氨氮标准工作溶液，按“1.2”方法测定滤纸上荧光物质的激发光谱和荧光光谱，结果如图4所示。由图4可见，OPA与氨氮反应所生成荧光物质的最大激发波长λex=368 nm，最大发射波长λem=426 nm，与OPA液相荧光法的激发波长、发射波长一致［14－17］，说明氨氮与OPA和Na2SO3在滤纸上生成的荧光产物与在液相中的相同，均为荧光异吲哚化合物。因此，本实验设置激发和发射波长分别为368 nm和426 nm。

图4 荧光物质的激发光谱(a)和荧光光谱(b)Fig.4 Excitation(a)and emission(b)spectra of the products of OPA－NH3－sulfite reaction on the filter paper

2.2 实验参数的优化

2.2.1 滤纸浸泡时间的优化 滤纸浸泡于OPA－Na2SO3混合液中的目的是使其充分负载可与氨氮反应的荧光试剂，理论上，时间过短，负载不饱和，可能会影响后续的固相荧光反应。为考察滤纸浸泡时间对实验结果的影响，固定其它实验条件如“1.2”所述，采用单因素法考察空白和8.00 μmol/L氨氮标准工作溶液对应的荧光测定值与滤纸浸泡时间的关系。结果表明，当滤纸浸泡时间介于15 min～2.0 h时，随着浸泡时间的增加，空白和8.00 μmol/L氨氮标准工作溶液对应的荧光测定值呈先增后降的趋势;当浸泡时间超过2.0 h时，荧光测定值逐渐趋于稳定。考虑到方法的可重复性和易操作性，实验选择将滤纸浸泡超过4.0 h后使用。

2.2.2 滤纸浸泡液中OPA与Na2SO3浓度的确定 滤纸浸泡液为OPA－Na2SO3混合溶液，本课题组的前期研究结果［18］表明，OPA及Na2SO3与氨氮在液相溶液中反应的最佳浓度为OPA:0.457～0.913 g/L，Na2SO3:0.081～0.326 g/L。参照该结果，本实验选择滤纸浸泡液中OPA浓度为0.795 g/L，Na2SO3浓度为0.250 g/L。

2.2.3 反应液pH值的优化 氨氮在水溶液中通常以NH+4和NH3两种形态存在，当水溶液pH值大于9.75时，主要以NH3形态存在［19］。本方法的反应原理是水样中的氨氮在碱性溶液中以NH3形态逸出反应液，与滤纸上的反应试剂反应生成荧光产物。因此，反应液的pH值会影响NH3形态在反应液中的含量，进而影响滤纸上生成的荧光产物量。为了考察反应液pH值对实验结果的影响，固定其它实验条件如“1.2”所述，通过改变1.0 mol/L NaOH溶液的加入量以改变反应液的pH值，考察了空白和8.00 μmol/L氨氮标准工作溶液对应的荧光测定值与pH值(10.0～13.0)的关系，结果如图5所示。在此pH值范围内，空白和8.00 μmol/L氨氮标准工作溶液对应的荧光测定值随着pH值的增大先增加，当pH值超过11.5后，荧光测定值趋于稳定。因此，本方法反应液的适宜pH值为11.5～13.0。另外，在50 mL反应液中加入4.0 mL EDTA－NaOH缓冲溶液，可控制河水、地下水、山泉水、纯水等水样的pH值在本方法的适宜pH值范围内，因此，实验选择在反应液中加入4.0 mL EDTA－NaOH缓冲溶液以控制反应液的pH值。

图5 反应液pH值对空白(a)及8.00 μmol/L氨氮标准工作溶液(b)荧光反应的影响Fig.5 Effects of pH values of reaction solution on fluorescence reaction of blank(a)and 8.00 μmol/L ammonium solution(b)

2.2.4 反应平衡时间的确定 配制8.00 μmol/L氨氮标准工作溶液，固定其它实验条件如“1.2”所述，分别在不同时间点测定其荧光强度。发现反应时间为30～165 min时，荧光测定值快速增加;反应时间为165～210 min时，荧光测定值趋于稳定，说明反应已达平衡，因此本方法选择反应平衡时间为165 min。

2.3 工作曲线与检出限

2.3.1 工作曲线 在优化实验条件下，分别配制氨氮浓度为2.00，3.00，4.00，8.00，12.0 μmol/L的系列标准溶液，按照实验方法进行测定。结果显示，荧光测定值与反应液中氨氮浓度在2.00～12.0 μmol/L范围内呈良好的线性关系，其回归方程为IF=12.10c(μmol/L)+177.6(n=5，r=0.993 5)。

2.3.2 检出限 采用本方法平行测定7个空白样，荧光测定平均值为91.244，标准偏差为4.53，按照检出限=3×SD/工作曲线斜率［20］，计算得本方法的检出限为0.746 μmol/L。当天工作曲线的回归方程为:IF=18.21c(μmol/L)+89.10(n=4，r=0.998 0)。

2.4 方法验证

2.4.1 加标回收率 以泉水、河水作为基底，分别加入不同浓度的氨氮测定基底加标回收率，结果见表1。由表1知，加标浓度分别为3.00，6.00 μmol/L时，泉水的基底加标回收率分别为(101.6±14.3)%、(96.6±4.8)%，河水的基底加标回收率分别为(89.6±6.5)%、(91.7±5.0)%，说明本方法可用于测定泉水和河水中的氨氮，基底均无干扰。

表1 泉水和河水基底的加标回收率(n=3)Table 1 The matrix spiked recoveries of spring and river sample(n=3)

2.4.2 与靛酚蓝分光光度方法的比较 靛酚蓝分光光度法［21］是测定氨氮的经典方法，采用本方法与靛酚蓝分光光度法对取自桂林市花江的两个河水样品进行测定，并对两者的结果做t统计检验，结果列于表2。表2数据表明，两个河水样品的统计量t的计算值均小于置信度为95%时的临界值，说明本法用于河水样测定与靛酚蓝分光光度法的结果无显著差异。

表2 本法与靛酚蓝分光光度法测定结果的比较(n=3)Table 2 Comparison of analytical results of the proposed method and the indophenol blue method(n=3)

2.5 方法的应用

2014年11月22日取自花江上游到下游的14个水样，立即用本法和靛酚蓝分光光度法［21］进行测定。当水样中氨氮的浓度大于12.0 μmol/L，用本法测定时，水样需稀释后方可进行。以靛酚蓝方法的测定结果为横坐标，本法的测定结果为纵坐标，作线性相关图。结果表明，花江水样中氨氮浓度在2.50～34.0 μmol/L范围内，本方法与靛酚蓝分光光度法的测定结果呈显著线性相关，相关方程为y=1.177x－0.759(n=14，r=0.992 5)，其斜率为1.177，接近1.0，说明本方法测定河水样与靛酚蓝分光光度法的测定结果无显著差异，能准确测定河水样中氨氮的含量。

3 结论

本文基于OPA－NH3－Na2SO3的荧光反应，以滤纸为固相载体，建立了操作简单、试剂消耗少、灵敏度高、成本低的固相荧光分析方法。该方法的线性范围为2.00～12.0 μmol/L，检出限为0.746 μmol/L，基底加标回收率为89.6%～101.6%。用本法与靛酚蓝分光光度法测定河水样，两者的测定结果无显著性差异。相对于其它测定氨氮的光谱分析方法，本方法无需对水样进行预处理，操作简便，成本较低。

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