光谱法及分子模拟法研究杨梅素与ct-DNA的相互作用

李 悦，何 华，肖得力，朱鸣阳

(1．天津医学高等专科学校 药学与医学检验技术系，天津 300222;2．中国药科大学 分析化学教研室，江苏 南京 211198)

黄酮类化合物是天然药物中的重要组分，其抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗过敏的生物活性和药理学作用对于新药研发中的靶点选择、先导物活性筛选、临床药理研究等过程具有重大意义［1－3］。杨梅素(3，3’，4’，5，5’，7-六羟基黄酮，Myricetin，MYR，结构式见图1)属于天然黄酮醇类活性成分，源自杨梅科杨梅属植物杨梅(Myrica rubra(Lour.)Sieb.et Zucc.)树叶、皮、根的提取物，作为抗氧化剂表现出良好的自由基清除能力［4］。除抗氧化、降低神经毒性、拮抗血小板活化因子、降低血糖、降血脂以及保护肝脏的功能外，杨梅素还能通过细胞因子诱导RIN－m5F β细胞凋亡，表达出一定的抗肿瘤、抗基因突变活性［5－7］。美国保健品药FYI使用杨梅素治疗预防关节炎和各种炎症，尤其适用于怀孕妇女和哺乳期婴儿。

许多抗肿瘤药物在细胞内均以DNA作为靶向［8－9］，通过与癌细胞的DNA发生相互作用破坏其双螺旋结构，进而影响基因调控与表达功能，抑制DNA的复制、转录，最终导致癌细胞的凋亡。探索小分子药物与DNA的作用机制，有助于进一步研究抗肿瘤药物在人体内的药动学和药效学过程，为药物筛选提供相关信息。药物与DNA不同作用模式的研究结果可用于设计新型有效药物并有助于研究DNA的结构，具有一定的研究价值和实际意义。已有文献报道黄酮醇类活性成分槲皮素、木犀草素、芹菜素等能通过与DNA发生嵌插结合，改变碱基对的结构，从而发挥抗肿瘤作用［10－12］。杨梅素的B环具有3个醇羟基，较上述几种药物多。化学结构的差异是否会对药物与DNA结合模式产生影响有待于进一步研究和探索。

本文采用紫外光谱法、荧光光谱法、圆二色谱法(CD)以及分子模拟共同研究了杨梅素与ct-DNA的相互作用模式、结合位点和结合常数、猝灭常数、分子间作用力和结合距离等作用机制。为进一步理解黄酮醇类活性成分的结构与抗肿瘤作用机理提供了依据，为合理改善药效和设计研发新药奠定了基础，对于从分子水平上研究药物小分子与DNA相互作用的机制具有重要意义。

图1 杨梅素的分子结构式Fig.1 Chemical structure of myricetin(MYR)

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

RF－5301 PC荧光分光光度计、UV 2100型紫外－可见分光光度计(日本岛津公司);PHS－25型酸度计(上海第二分析仪器厂)。

三羟甲基氨基甲烷(Tris，上海精细化工试剂有限公司);小牛胸腺DNA(ct-DNA，Sigma公司)用pH 7.4的Tris－HCl缓冲液(含0.1 mol·L－1NaCl)溶解，浓度通过260 nm处的紫外吸收确定，DNA在260 nm处的吸光系数为6 600 mol－1·cm－1，于4℃保存;杨梅素(南京泽朗生物科技有限公司)用pH 7.4的Tris－HCl缓冲液配成4.6×10－4mol·L－1储备液备用;实验所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 紫外－可见吸收光谱法 于10 mL比色管中依次加入1.0 mL的Tris－HCl缓冲溶液(pH 7.4)、1.0 mL 4.6×10－5mol·L－1杨梅素溶液和不同体积的ct-DNA储备液，稀释至刻度后摇匀，室温放置10 min。以相应浓度的ct-DNA与Tris－HCl的混合溶液为参比，于UV－Vis分光光度计上扫描杨梅素在240～440 nm范围内的紫外吸收光谱，狭缝宽度为1.0 nm。

1.2.2 荧光光谱法 取3 mL 4.6×10－6mol·L－1杨梅素溶液于石英吸收池中，用微量注射器逐次加入浓度为1.1×10－4mol·L－1的ct-DNA溶液进行滴定，加样体积由实验点浓度计算确定(滴定剂累加体积小于100 μL)。以360 nm为激发波长，绘制500～600 nm波长范围的荧光光谱。

1.2.3 圆二色谱法 移取一定量的ct-DNA溶液和杨梅素溶液于10 mL比色管中，以Tris－HCl缓冲液定容。使用1 mm石英池，于室温下测定220～320 nm范围内ct-DNA与杨梅素发生相互作用前后的CD谱。

1.2.4 热变性效应 将ct-DNA在沸水浴中加热15 min后，迅速放入冰水浴中冷却10 min，制成热变性DNA。按照“1.2.2”实验步骤，在同样浓度范围内，测定变性DNA和天然双链DNA在上述溶液中的荧光光谱。

1.2.5 分子模拟研究 DNA序列d(CGCGAATTCGCG)双链结构由蛋白质数据库(PDB)提供(PDBid:1BNA)，通过Auto Dock Tools软件平台建立受体DNA和配体杨梅素的模型。DNA格点坐标设置为X×Y×Z=106×100×76，格点间距为0.375，格点中心距离设置为X轴14.719，Y轴20.979，Z轴8.824。运用Auto Grid 4程序计算格点中的相关能量，Auto Dock 4程序将杨梅素与DNA分子对接，采用拉马克遗传算法探索配体全范围的柔性构象和受体的局部柔性，充分搜索构象空间，并以结合能量最低的结构作为相互作用的最优模式。

2 结果与讨论

2.1 ct-DNA与杨梅素相互作用的吸收光谱

紫外－可见吸收光谱能够简单而有效地检测出药物与DNA的结合情况。当小分子和DNA相互作用并形成新的复合物时，通常伴有吸收强度和吸收带位置的变化［13］。不同浓度ct-DNA对杨梅素紫外光谱的影响见图2。杨梅素的浓度为4.6×10－6mol·L－1，最大吸收波长位于370 nm，随着ct-DNA浓度的增加，紫外光谱有明显的减色现象，表明杨梅素与DNA发生了相互作用，两者的结合方式可能为沟槽结合［14］。同时紫外光谱未伴随有最大吸收波长位置的移动，显示两者的结合形式为非嵌插作用［15］。

图2 ct-DNA对杨梅素紫外吸收光谱的影响Fig.2 UV－Vis absorption spectra of MYR in the absence and presence of ct-DNA

2.2 荧光光谱法

2.2.1 ct-DNA对杨梅素的荧光猝灭 荧光猝灭机制的研究可为考察杨梅素与ct-DNA的相互作用模式提供重要的理论依据。298 K条件下向杨梅素中加入ct-DNA后，杨梅素的荧光强度依次降低(图3)，说明ct-DNA可使杨梅素的固有荧光猝灭，证实了ct-DNA与杨梅素能发生相互作用。利用Stern－Volmer方程对荧光猝灭现象进行分析:

式中，F0和F分别为ct-DNA不存在和存在时杨梅素的荧光强度，［Q］为ct-DNA的浓度，Kq为双分子碰撞猝灭常数，Ksv为Stern－Volmer猝灭常数，τ0为ct-DNA不存在时荧光分子的平均寿命。以F0/F对［Q］作图，得到室温下ct-DNA对杨梅素荧光猝灭的Stern－Volmer曲线(图3插图)为一直线，r2=0.998。

从表1中可以得到Kq值(Kq=Ksv×108)数量级为1011，远大于各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭常数2.0×1010L·mol－1·s－1，且猝灭速率常数随温度的升高而降低，说明ct-DNA对杨梅素的荧光猝灭类型为静态猝灭。表1中，不同温度下的Ksv值与大多数沟槽结合模型的Ksv值一致［16］，明显低于常见嵌插结合试剂的Ksv值，如溴化乙锭(EB)的Ksv为1.3×104mol－1。说明杨梅素与DNA结合的亲和力与嵌插结合相比较低，进一步证明两者间的结合模式为沟槽结合［17］。

图3 ct-DNA对杨梅素荧光光谱的影响Fig.3 Fluorescence spectra of MYR in the presence of varying concentrations of ct-DNA

ct-DNA与杨梅素相互作用的结合常数和结合位点数能够为其作用机制的研究提供非常关键的信息，依据药物代谢动力学的相关理论可知，药物与DNA的结合常数越大，说明其在靶细胞处发挥药效的可能性越大，而结合位点数的确定有助于结合模式的判断。表1显示结合常数随温度的升高而降低，说明温度是影响结合能力的有力因素。Ka值低于典型的嵌插结合模型中的结合常数，进一步证明其沟槽结合的可能性［18］。

表1 杨梅素－DNA体系的猝灭常数、结合常数及结合位点数Table 1 Stern－Volmer quenching constant and binding constant Ka，number of binding sites n of MYR －DNA system

2.2.2 杨梅素与MB竞争ct-DNA结合位点的研究 亚甲基蓝(MB)是一种常见的DNA嵌插结合剂，故常用作荧光探针来研究药物与双链DNA的结合机制［19］。图4A显示，通过嵌插结合，MB自身的荧光强度和最大发射波长发生明显改变，DNA能够猝灭MB的荧光强度(从450降至140)，同时发射波长蓝移(从690～673 nm)，说明两者结合生成了复合物。如果杨梅素也能通过嵌插作用与DNA结合，将会与MB共同竞争DNA上的结合位点，从而导致MB－DNA复合体系的荧光强度显著下降［20］。图4B为室温条件下，杨梅素甲醇溶液滴定MB－DNA体系的荧光光谱。实验结果表明，随着杨梅素甲醇溶液浓度的增加，MB－DNA体系的荧光强度逐渐增强(从240升至270)，并发生红移(从692 nm移至694 nm)，说明杨梅素未能将MB置换出复合体系，两者未形成竞争机制，而是与MB－DNA形成新的三元体系，进一步证明杨梅素与DNA的结合方式不同于MB的嵌插结合。

图4 ct-DNA对MB荧光光谱的影响(A)以及杨梅素甲醇溶液滴定MB－ct-DNA体系的荧光光谱(B)Fig.4 Effect of ct-DNA on fluorescence spectra of MB(A)and fluorescence spectra of MB－ct-DNA complexes in the presence of different concentrations of MYR(B)

2.2.3 热力学参数的测定 小分子和生物大分子之间的主要结合力可通过焓变(ΔH)、熵变(ΔS)进行判断。从热力学角度，ΔH＞0，ΔS＞0，说明结合力为疏水作用;ΔH＜0，ΔS＜0为范德华力和氢键力;ΔH＜0，ΔS＞0为静电力［21］。如果温度变化很小，焓变可被视为常数，其值和熵变可由van’t Hoff方程计算:

式中，Ka为对应温度下的结合常数，R为气体常数。由上式可知，以lnKa(y)对1/T(x)作图，其线性方程为y=3 362x－3.751，r2=0.999。由斜率和截距分别可以计算出焓变ΔH、熵变ΔS以及吉布斯自由能变ΔG(见表2)。

表2 杨梅素与DNA相互作用的热力学常数Table 2 Thermodynamic parameters for the association of myricetin with ct-DNA

由表2可见，ΔG为负值，说明该体系的结合为自发过程。焓变大于熵变，说明杨梅素与DNA之间的结合为焓驱动过程;ΔH，ΔS均为负值，表明两者的结合主要基于氢键和范德华力。DNA碱基对之间依靠氢键连接，实验结果表明杨梅素可能通过氢键作用于大沟或小沟的碱基对边缘，具有一定特异性。

2.2.4 杨梅素与热变性DNA的相互作用 DNA的双螺旋结构因具有氢键作用力和碱基堆积作用而非常稳定。随着温度的升高，一些化学键被破坏，双螺旋解离为单链结构，不利于小分子的嵌插结合。如果杨梅素通过嵌插作用与DNA结合，当发生热变性效应解旋为单链DNA(ssDNA)后，碱基对被破坏，DNA解螺旋，两者不能再发生相互作用，ssDNA对杨梅素的猝灭强度会显著降低。

通过荧光实验考察未变性的双链DNA(dsDNA)与变性的单链DNA同杨梅素的相互作用，并以F0/F对浓度作图，对比正常双链DNA与变性单链DNA在结构方面的差异(图5)。dsDNA对杨梅素的猝灭常数Ksv为1.87 ×103mol－1(r=0.995 5)，ssDNA 的猝灭常数 Ksv为1.42 ×103mol－1(r=0.994 6)。说明dsDNA和ssDNA均可对杨梅素的荧光产生猝灭作用，且变性后得到的ssDNA猝灭杨梅素荧光的能力略有降低。这说明杨梅素与DNA的主要作用模式不是嵌插作用，而是通过沟槽结合的方式发生相互作用。

图5 dsDNA和ssDNA与杨梅素相互作用的Stern－Volmer曲线图Fig.5 Stern－Volmer plots for MYR quenching by dsDNA and ssDNA

2.3 圆二色光谱

圆二色光谱用于研究杨梅素与DNA的结合对DNA构象的影响。圆二色光谱的信号强度改变与DNA结构的变化有对应关系。DNA的CD谱由245 nm处的负峰和276 nm处的正峰组成，前者对应DNA的右手螺旋B构象，后者对应DNA的碱基堆积，两者均对DNA与小分子的相互作用模式非常敏感。小分子与DNA的沟区结合和静电结合对碱基堆积和螺旋的色带影响很小或几乎没有影响，而嵌插结合会改变色带的稳定和DNA的右手螺旋B构象［22－23］。

无配位体或药物存在以及加入2.3 μmol·L－1杨梅素时DNA的圆二色光谱见图6。图6可见，与游离DNA的圆二色光谱相比，杨梅素的加入使得谱图的正峰和负峰强度略有减弱，同时正峰位伴有轻微蓝移(约1.0 nm)，说明杨梅素能轻微减弱DNA的碱基堆积作用和双螺旋结构，但未能形成嵌插结合，DNA仍保留B型结构。

图6 DNA(a)与DNA－杨梅素复合物(b)的圆二色谱图Fig.6 CD spectra of DNA(a)and DNA－MYR complex(b)

2.4 分子模拟研究

分子模拟技术广泛应用于生物大分子物质与配体的相互作用研究，其结果具有直观性、准确性，并能与光谱实验结果互相证明，互相补充［24］。通过Auto Grid 4和Auto Dock 4的程序计算，从运行得到的10个可能存在的结构中筛选出6个RMSD值(Root mean square deviation，均方根偏差)为0的最低能量构象。再通过筛选找到这6种构象中结合能(Binding energy)最低的，即为分子模拟杨梅素与DNA相互作用的优势构象(表3)。图7A和B显示，杨梅素与DNA作用的优势构象位点位于双螺旋内部的小沟中，属于沟槽结合，此时复合物的结合能为－29.2 kJ/mol，周围富含A－T碱基对，包括DA5－DT20，DA6－DT19，DT7－DA18和DA8－DT17。此时分子间能(Intermolecular energy)为 －37.95 kJ/mol，分子内能(Internal energy)为 －12.51 kJ/mol，扭转能量(Torsional energy)为8.74 kJ/mol，非键合扩散能(Unbound extended energy)为 －12.51 kJ/mol，范德华力、氢键作用力和溶解作用力共同产生的能量EVHD为－37.61 kJ/mol(vdw_Hbond_desolv_energy)，静电作用能量(Electrostatic energy)为－0.33 kJ/mol，表明杨梅素与DNA是通过范德华力和氢键发生作用。图7C显示，杨梅素A环中7位OH和B环中3’位OH中的O被氢键中的O所形成的氧亲和性口袋所浸没，说明氢键是分子间相互作用的主要类型，同时指出了配体中相应位点的O是分子结构中的活性位点，这对于研究药物结构与药理活性之间的关系具有重要启示。图7D进一步明确了配体与碱基对的作用力类型和结合位点，其中结合位点与图7C的预测一致:杨梅素A环中的7-O与A链DA18、B环中的3’-O与B链DA6通过氢键结合，结合距离分别为2.061和1.918，说明杨梅素与DNA中的腺嘌呤A能够通过氢键的方式发生相互作用。这与热力学研究结果一致，体现了分子模拟研究对光谱学实验结果的印证和支持。

表3 Auto Dock 4程序模拟出的杨梅素与DNA结合可能存在的不同构象Table 3 Docking summary of DNA with MYR by the Auto Dock 4 program generating different ligand conformers

图7 DNA片段与杨梅素配体的分子模拟结果Fig.7 Molecular docked model of MYR with DNA dodecamer duplex of sequence d(CGCGAATTCGCG)2(PDB ID:1BNA)

3 结论

本文采用紫外吸收光谱、荧光光谱、圆二色谱法和分子模拟法共同探索了黄酮类药物杨梅素与ct-DNA的相互作用机制。实验结果表明，杨梅素与ct-DNA通过沟槽结合方式发生相互作用，结合位点位于双螺旋边缘的小沟，周围富含碱基A和T，这对于抗肿瘤药物是一种有意义的重要结合方式。具体结论如下:①荧光光谱实验表明，ct-DNA能够猝灭杨梅素的内源荧光，猝灭方式为静态猝灭，猝灭常数与沟槽结合剂一致，明显小于嵌插结合剂，相互作用的结合常数和结合位点数分别为1.86×103mol－1和1。②热力学参数的计算结果显示，杨梅素和DNA主要通过氢键和范德华力相互作用。③变性后的ssDNA虽然双螺旋结构解旋，碱基对排列次序改变，但对杨梅素的荧光猝灭效果未发生明显变化，说明两者并非通过嵌插结合。④圆二色光谱的研究表明，杨梅素未能诱导ct-DNA的二级结构发生改变。⑤分子模拟的实验结果表明，杨梅素与DNA结合的优势构象位于双螺旋内的小沟，药物分子中的7-O和3’-O可与DA18和DA6这两对碱基中的H形成氢键，这与热力学实验结果一致。上述研究结论对于设计、合成、筛选抗癌药物有重要意义，对于实现按照预先设计的结合位点，合成高度专一性的新药，以及对疾病的治疗均有指导意义。

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