基于智能手机数字比色法的有机磷农残快速检测技术研究

杨冬冬，张校亮，崔彩娥，谭 慷，李晓春

(太原理工大学 物理与光电工程学院，新型传感器与智能控制教育部与山西省重点实验室，山西 太原 030024)

有机磷农药是我国使用量最大的农药之一，作为杀虫剂被广泛应用于蔬菜和水果中。农药的过度使用会导致残留农药不能彻底降解，最终进入人体内。有机磷农药会抑制人体内胆碱酯酶的活性，导致胆碱的大量积累并频繁刺激神经系统，从而对人体神经系统造成损害。我国卫生部、农业部于2012年发布了GB2763－2012《食品安全国家标准、食品中最大农药残留限量》［1］，对食品中有机磷农药的最大残留量做出了明确规定。因此有必要开发一种有效便捷的有机磷农残检测方法来保障食品安全。

有机磷农残的检测方法有气相色谱法(GC)［2］、高效液相色谱法(HPLC)［3］、气相色谱－串联质谱法(GC－MS)［4］、液相色谱－串联质谱法(LC－MS)［5］和QuEChERS提取与超高效液相色谱－电喷雾电离串联质谱联用法［6］等。这些方法具有适用范围广、分离效能高、准确、灵敏、重复性好、选择性强等优点，但存在仪器设备昂贵、操作复杂、耗时长等不足，因此难以满足农残现场快速检测的要求。Ellman等［7］根据有机磷农药对酶的抑制作用提出了有机磷农药的酶抑制检测法。基于比色分析的有机磷农残的酶抑制检测方法是近几年发展起来的一种分析方法［8］，与传统色谱法和光谱法相比，基于比色法分析农残更加直观，普通用户可以通过肉眼观察反应溶液的颜色进行定性判断，或者通过对数字图片检测区域色度的分析实现定量检测。

近年来，随着智能手机的广泛普及以及其功能的不断强大，基于智能手机的数字图片比色分析(Digital image colorimetric，DIC)作为一种新型、快速的定量检测方法被研究者所重视［9－11］。用手机采集图片时由于光照条件不同，会对成像质量产生很大的影响，最终将直接影响待检物的定量检测。为了解决这一问题，研究者们着手从软件算法和特殊光源光路上进行改进。Shen等［12］在分析数字图片时通过映射算法将不同光强环境(荧光3 500 K，日光，阴影，手机闪光灯)下所得的颜色色度值转化为定值光强(荧光5 000 K)下的色度值，实现了不同光照强度下颜色的统一;随后，Hong等［13］分别将荧光、日光以及低照度光强等不同光强下采集到的图片经过颜色校正算法转换为颜色相同的图片进行比色分析。Garcia等［14］在检测水溶液中钾离子时采用了一个封闭装置，并使用3个对称放置的LED灯珠作为光源;Suzuki等［15］在检测水中余氯时采用LED阵列作为光源。在封闭装置中检测和使用LED阵列光源均在一定程度上控制了环境光照的影响。但是，当光源的放置位置不合适时，采集的照片会有阴影出现，这将很大程度地影响检测结果。2013年，Bang－iam等［16］在检测天然乳胶和医用乳胶中的蛋白质时通过实验证明:只用一个LED灯珠不能采集到完美的图片，而放置两个与样品成45°的LED灯则能采集到理想的图片。

综上所述，在基于智能手机的数字图片比色法的应用中，环境光照的条件将直接影响检测结果的准确性。由于LED面光源具有较好的光线平行度，将其置于样品上方时，手机能采集到无阴影的图片。更为重要的是，在图片采集过程中，较大的光源面积可以实现样品区域的均匀照明，因此无需将光源放置在特定角度的位置。鉴于此，本文采用LED“面光源”作为照明光源，以智能手机作为图片采集工具，从而实现了有机磷农残的快速、定量检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

马拉硫磷标准液(100 μg/mL，溶于丙酮)购于国家标准物质中心，使用前置于药品保存箱(4℃)中保存。有机磷农残检测试剂盒(石家庄诺威亚生物试剂有限公司)包括:乙酰胆碱酯酶、硫代乙酰胆碱、显色剂(二硫代双硝基苯甲酸)、磷酸盐缓冲液，干粉状态下的试剂使用前置于低温冰箱(－20℃)中保存，配成溶液后置于药品保存箱(4℃)中保存。实验用的黄色墨水为爱普生喷墨打印机(R270系列)原供黄色墨水。供试苹果购于当地超市。

LED面光源(18 cm×18 cm，12 W，佛山飞力照明科技有限公司)，智能手机(Coolpad8736，Mi2，Samsungi9300)，UV－3100PC紫外可见分光光度计(上海美普达科技有限公司)，SK－1快速混匀器(金陵市科析仪器有限公司)，Pipet－LiteXLS手动单道移液枪(美国梅特勒托利多公司)，HC－2518高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，石英比色皿(宜兴市和桥科化仪器厂)，超纯水仪(Gen-Pure UV－TOC/UF with Dispenser，美国赛默飞世尔科技公司)。

1.2 样品的制备

由于实验最终产物呈黄色，故选择黄色墨水作为前期优化条件所用样品。配制4 000 μL黄色墨水样品，其中墨水的体积分别为0，200，400，600，800，1 000，1 200，1 400，1 600，1 800 μL，用水稀释至4 000 μL。经稀释后墨水的体积分数(墨水体积与总体积之比)分别为0%，5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%。10个样品置于离心管中，并取1 000 μL样品置于比色皿供手机拍照以及颜色分析。

将丙酮中的马拉硫磷标准液用水分别稀释至 0，0.05，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μg/mL，各取500 μL置于离心管中。取乙酰胆碱酯酶、显色剂各25 μL加至上述马拉硫磷标准液中，在37℃恒温箱中温育30 min后，加入25 μL硫代乙酰胆碱制成马拉硫磷检测液，取575 μL检测溶液至比色皿中，待反应进行15 min后，使用手机采集图片并进行颜色分析。

将用于样品测试的苹果等分为5份，用水清洗干净后置于通风处晾干，分别在每块苹果表皮喷洒浓度为0，10，20，30，40 μg/mL的马拉硫磷溶液。3 h后，分别削取2 mg苹果表皮置于样品瓶中，各加入10 mL磷酸盐缓冲液后用快速混匀器混匀10 min，取上清液500 μL于离心管中，10 000 r/min离心10 min，待用。

1.3 DIC图片采集装置及颜色处理

如图1A所示，LED面光源作为手机数字图片采集时的照明装置，置于比色皿正上方，智能手机置于样品正前方进行图片采集，整个装置置于暗室环境中，图片保存格式为.Jpeg格式。采集到的图片经分析软件(Adobe Photoshop CS6.0)读取 Y值。Y值是指在CMYK(Cyan，Magenta，Yellow，Black)颜色模型中用来表示图片所含黄色成分的百分比(范围为0%～100%)。其中，图片黄色越深，Y值越大，反之Y值越小，具体读取方法如图1B所示。

2 结果与讨论

2.1 检测原理及光谱特性

酶抑制法检测马拉硫磷的原理［7］见图2，硫代乙酰胆碱(ATCh)在乙酰胆碱酯酶(AChE)的作用下水解，水解产物硫代胆碱在显色剂二硫代双硝基苯甲酸(DTNB)作用下产生黄色物质5-硫代2-硝基苯甲酸(TNB)，当反应溶液中存在有机磷农药时，乙酰胆碱酯酶的活性被抑制，水解产物硫代胆碱变少，最终导致黄色物质TNB的量变少，检测液的黄色变浅。为了进一步研究有机磷农残抑制酶的原理，考察了反应溶液的紫外－可见吸收光谱特性。反应溶液中加入底物之后立即进行吸收光谱测量。此后，每隔10 min测1次溶液的吸收光谱，结果如图3所示。

图1 DIC图片采集装置(A)与Y值读取窗口(B)Fig.1 Schematic diagram of DIC device(A)and the window for Y value reading(B)

图2 马拉硫磷酶抑制法的检测原理Fig.2 Principle of malathion detection based on enzyme inhibition method

图3 每隔10 min测得的反应溶液的光谱特性Fig.3 UV－Vis spectra of the detecting solution obtained for every 10 min

由图3A可知，在未加马拉硫磷的条件下，吸收光谱在250～550 nm范围内有两个明显的吸收峰。且随着时间的推移，320 nm处的吸光度逐渐下降，而412 nm处的吸光度逐渐增加，直至反应进行约1 h后，吸光度达到饱和。值得注意的是，412 nm处的吸收峰为反应的最终黄色产物TNB的吸收峰，随着其含量的增加，412 nm处的吸光度逐渐增加，约1 h后达到饱和。图3B为加入8 μg/mL马拉硫磷后溶液的光谱特性，与图3A相比，两个吸收峰的位置未发生移动，但达到饱和的时间增加到2 h。说明马拉硫磷抑制了酶的活性，进而降低了反应速度。

2.2 DIC图片采集装置测试

为考察所用LED面光源在图片采集装置中的可靠性，使用Coolpad8736智能手机对10个体积分数均为15%的黄色墨水(编号1～10)在自然光和LED面光源下分别进行图片采集，并做结果分析(如图4)。由图4A可见，自然光照下所采集到的图片有很严重的阴影，而LED面光源照明下所采集到的图片亮度均匀无阴影，图片质量有明显提高。进一步对这10个样品分别进行颜色均匀程度分析，结果如图4 B～C所示。由图看出，自然光下由于背景很大，采集到的图片Y值整体偏高，并且每个位置处样品的颜色误差较大。相比之下，采用LED作为照明光源，采集到的图片颜色误差很小。这充分说明在自然光下采集到的图片颜色不均匀而导致颜色误差增大。

图4 自然光(上)和LED面光源(下)采集的黄色墨水图片(A)，以及10个样品的Y值分析结果(B)与Y值的标准偏差(C)Fig.4 The yellow ink images obtained under ambient(upon)and LED source(down)(A)，Y value(B)and standard deviation of Y value(C)of ten samples with same content of ink

在自然光和LED面光源的照明条件下，采集了体积分数为0%～45%的10个黄色墨水样品图片，并进行了颜色分析，如图5所示。由图可知，在LED面光源的照明条件下，所采集到的图片质量有了大幅增加，且LED面光源下墨水含量在0%～45%范围内均保持良好的线性关系，而自然光下墨水含量仅在0%～25%范围内与Y值的线性关系很好，且由于自然光下背景较大，使得墨水含量大于30%即达到饱和，导致较高浓度的墨水含量不能区分。实验结果表明，LED面光源相较于自然光在数据分析上有很大的优势，能大幅提高检测的灵敏度。

图5 自然光(上)和LED面光源(下)采集的不同含量黄色墨水图片(A)，以及黄色墨水含量与Y值的关系(B)Fig.5 The yellow ink images obtained under ambient(upon)and LED source(down)(A)and relationship between Vink/Vtotaland Y value(B)

2.3 不同品牌智能手机对图片采集的影响研究

为了验证不同品牌的智能手机在比色分析中的普适性，以黄色墨水为实验样品，在LED面光源照明下分别以Huawei，Coolpad，Samsung 3款智能手机(参数见表1)为图片采集工具，对体积分数为0%～40%的黄色墨水进行图片采集，并进行色度值分析。实验结果显示，3款智能手机所采集到的图片略有差异。图片的色度值分析结果显示，3款手机所测得的Y值分布趋势完全相同，只是Y值大小略有差别，Samsung分析的Y值最大，其次是Coolpad，Huawei分析的Y值最小(图6)。从表1可以看到，3款智能手机的F数值各不相同，从小到大依次是 Huawei，Coolpad，Samsung。表明F数值越小，进光量越多，则获得的画面更亮;而F数值越大，进光量越少，则画面较暗，因此Y值略有差异。

表1 3款智能手机的参数及其设置Table 1 Parameters and setting of the three different bands smartphones

2.4 基于数字图片比色分析的马拉硫磷检测

以Coolpad8736智能手机为图片采集工具，对马拉硫磷进行检测。实验中，加入底物摇匀溶液后用移液枪将显色后8个浓度(0～10.0 μg/mL)的马拉硫磷检测液转移到比色皿中，反应15 min后，在LED面光源照射下进行图片采集，同时作为对比，测量了待检溶液反应15 min后在412 nm处的吸光度值，分析结果如图7所示。从图7A可以看到，随着马拉硫磷浓度的增加其Y值逐渐减小最终趋于饱和。吸光度值与马拉硫磷浓度的关系如图7B所示，随着马拉硫磷浓度的增加，溶液的吸光度值逐渐减少，直至饱和。将比色法所得结果与光谱分析法所得结果进行对比(如图7C)，两种方法的相关系数达到0.995 1，充分证明了本方法的可行性与准确性。

图6 黄色墨水体积比与3款智能手机采集黄色墨水图片Y值的关系Fig.6 Relationship between Vink/Vtotaland Y value by analyzing yellow ink images captured by three smartphones of different bands

图7 马拉硫磷标准品浓度与Y值的关系曲线Fig.7 Relationship between malathion concentration and Y value

2.5 未知样品的检测以及与传统紫外－可见分光光度法的结果对比

为了验证本方法在实际样品检测中的可靠性与准确性，以喷洒0，10，20，30，40 μg/mL 5个浓度的马拉硫磷溶液的苹果表皮作为待检样品。分别采用比色法与光谱分析法对样品进行定量检测(如图8)。由图可知，喷洒较高浓度马拉硫磷(10～40 μg/mL)的样品检测结果约为3.4～8.5 μg/mL，与UV－Vis分光光度计的结果一致。

3 结论

本文研究了基于智能手机数字图片比色法的有机磷农残速测技术，使用LED面光源作为图片采集光源，解决了自然光照下图片失真、背景大等问题，同时也弥补了LED点光源由于角度放置不合适而引起的图片失真问题。本方法具有普适性，不同的智能手机不会对检测结果产生影响。与传统的检测手段相比，本方法具有易操作、速度快、成本低等优势。在本方法的基础上，有望通过集成化研制出便携式测试盒，同时应用手机APP进行比色分析，以实现有机磷农残的实时、在线定量检测。

图8 DIC与紫外－可见分光光度计对样品检测的结果Fig.8 Detecion results for sample with DIC and UV－Vis spectrometry

［1］GB 2763 －2012．The Maximum Residue Limits of Pesticide in Food．National Standards of the People’s Republic of China(食品中农药最大残留限量．中华人民共和国国家标准)．

［2］Li X J，Chen A，Huang C，Shi J，Yu H．J.Instrum.Anal．(李晓晶，陈安，黄聪，施洁，于鸿．分析测试学报)，2011，30(3):326－329．

［3］Xuan Q J，Zhou C G，Xu H Z，Wang Y J，Lin Z S，Yao Z W，Lü J C．Chin.J.Anal.Lab．(宣秋江，周传光，徐恒振，王艳洁，林忠胜，姚子伟，吕景才．分析试验室)，2008，27:273－275．

［4］Du X T，Zhou M，Zhang J，Zeng Y B，Zhai Y Y，Li L．J.Instrum.Anal．(杜晓婷，周敏，张剑，曾延波，翟云云，李蕾．分析测试学报)，2010，29(7):751－754．

［5］Liu Q，Sun L，Zhang L．J.Instrum.Anal．(刘琪，孙雷，张骊．分析测试学报)，2010，29(7):747－750．

［6］Xu J，Chen J，Wang L，Sun L H，Yuan Z Y，Ye H Y，Zhu L．J.Instrum.Anal．(徐娟，陈捷，王岚，孙灵慧，袁震宇，叶弘毅，朱林．分析测试学报)，2013，32(3):293－301．

［7］Ellman G L，Courtney D K，Jr Anerds V，Featherstone R M．Biochem.Pharmacol．，1961，7(4):88 －95．

［8］Liang M M，Fan K L，Pan Y，Jiang H，Wang F，Yang D L，Lu D，Feng J，Zhao J J，Yang L，Yan X Y．Anal.Chem．，2013，85(1):308－312．

［9］Sumriddetchkajorn S，Chaitavon K，Intaravanne Y．Sens.Actuators B，2013，182:592 －597．

［10］Apilux A，Siangproh W，Praphairaksit N，Chailapakul O．Talanta，2012，97:388－394．

［11］Martinez A W，Phillips S T，Carrilho E，Thomas III S S，Sindi H，Whitesides G M．Anal.Chem．，2008，80(10):3699－3707．

［12］Shen L，Hagen J A，Papautsky I．Lab Chip，2012，12(21):4240 －4243．

［13］Hong J I，Chang B Y．Lab Chip，2014，14(10):1725 －1732．

［14］Garcia A，Erenas M M，Marinetto E D，Abad C A，Orbe－ Paya I，Palma A J，Capitán －Vallvey L F．Sens.Actuators B，2011，156(1):350－359．

［15］Suzuki Y，Endo M，Jin J Y，Iwase K，Iwatsuki M．Anal.Sci．，2006，22:411－414．

［16］Bang－iam N，Udnan Y，Masawat P．Microchem.J．，2013，106:270－275．