生物材料介入对ACL重建术后持续被动康复训练过程中腱-骨愈合的影响＊

潘玮敏，张明军，刘 民

（1．西安体育学院 健康科学系，西安710068；2．第四军医大学 西京医院骨科研究所，西安710021）

伴 随 前 交 叉 韧 带 （Anterior Cruciate Ligament，ACL）重建手术方法及固定器械的改善，大多患者，尤其年轻患者对于ACL重建术后短时间内恢复膝关节运动功能的诉求更为迫切，因而术后采取激进康复运动训练方式，诸如术后短时间内进行持续被动活动等带来的益处对这些人群更为吸引［1］．但是，对于采用腘绳肌肌腱重建ACL的患者来说，由于腘绳肌肌腱是单纯的腱性移植物，其两端仅依靠固定物固定于骨隧道的出口侧，术后激进的运动可能造成移植肌腱-骨隧道界面不同程度的微动，这种微动不可避免地会危及到界面的愈合过程，导致腱-骨界面的延迟愈合，从而可能影响ACL术后膝关节运动功能的恢复［2］．

以往学者为了促进ACL术后腱-骨界面的愈合，有学者应用了骨形态发生蛋白（BMP）促进二者之间骨的生长，并取得了较好的结果，但是局部BMP的有效浓度无法得到很好的维持［3］．而也有学者采用可注射性磷酸钙骨水泥（Injected Calcium Phosphate Cement，ICPC）［4］成骨的特性促进腱-骨的愈合．尽管早期获得了较好的生物力学结果，然而组织学结果发现，并非是新生骨的长入，而是二者之间存在的ICPC自身的生物力学强度在维持，究其主要还是ICPC降解缓慢导致新生骨无法长入．大多实验结果显示，真正的腱-骨愈合获得的生物力学强度主要与二者之间新生骨的长入呈现正相关［5］．因此，以往实验尝试性地通过提高ICPC孔隙率来改善ICPC的降解速度，从而克服ICPC降解缓慢为ACL术后腱-骨界面愈合带来的这一缺点．结果证实通过提高ICPC孔隙率后其降解速度也可以得到提高．因此在保持BMP活性引入条件下又提高ICPC孔隙率成为克服制约ICPC应用于腱-骨界面的关键因素．

在前期的实验中，制备了多孔隙、具有良好降解性能及生物诱导活性的杂合生物材料磷酸钙骨水泥／重组合异种骨粒（ICPCB），并将其应用于ACL重建术中．术后通过多指标的检测发现，ICPCB可有效地提高腱-骨界面间新生骨的形成，促进腱-骨界面早期愈合，界面间的生物力学功能也因此被提高，为术后膝关节运动功能的较快恢复奠定了良好的基础［6］．因此设想，将这种新型生物材料注射入腱-骨界面后，有可能降低激进康复训练带来不利作用，对于界面的愈合仍然起到正性的促进作用．因此本研究基于前期的技术，参考临床术后康复训练模式，将杂合生物材料ICPCB及单纯的磷酸钙骨水泥（ICPC）分别注射入腱-骨界面，比较二者对于ACL重建术后持续被动康复训练过程中界面愈合的影响，以期为临床膝关节功能的恢复提供理论基础．

1 材料与方法

1．1 生物材料的制备

注射型磷酸钙骨水泥（ICPC）购自上海瑞邦生物材料有限公司，主要由固态粉末和液态凝固剂构成．重组合异种骨粒（Reconstituted Bone Xenograft；RBX）由第四军医大学全军骨科研究所综合骨库提供，主要由经脱脂、脱蛋白的小牛松质骨（Bovine Cancellous Bone，BCB）与从同源皮质骨中提取的骨形态发生蛋白（BMP）粉末复合而成．在以往实验基础上［7-8］，依据 BMP／bCB 1∶20的比例，将3mgBMP与松质骨骨粒60mg复合，其中每个骨粒直径大小300μm左右．随后将RBX骨粒与1mL／2．5g ICPC复合．先将 RBX 骨粒与ICPC固态粉末混合均匀，然后将其与ICPC液态凝固剂混合，在5mL无菌注射器中充分抽吸混合后，即成黏性糊状的可注射材料．随后将其注射入磨具或骨道中凝固，凝固后即得杂合生物材料ICPC／RBX（ICPCB）．

1．2 ACL重建动物模型的建立

健康成年新西兰雌性大白兔21只（22周龄），购自第四军医大学动物实验中心．应用846复合麻醉剂肌注麻醉后（0．3mL／kg体重），仰位固定于术台，消毒后行双侧膝关节ACL重建术．首先膝关节前内侧切口，切开后向外侧将髌骨脱位，切断翼状皱襞，同时屈曲膝关节，将ACL完全显露并在两止点完全切除．在股骨外侧髁找到趾长伸肌肌腱止点，将其分离、截取作为肌腱移植物，剔除移植物肌性部分后，肌腱两端应用不可吸收缝线编织缝后留长约10cm作为牵引线．骨隧道的建立胫骨侧自胫骨隆突向ACL胫骨原止点打一条直径∅2．5 mm骨隧道；随后通过该骨道再向上、向外、向后至髁间窝外侧壁后部，靠近股骨原ACL止点向股骨外髁外侧打一条直径相同的骨隧道．移植肌腱用18G针头通过牵引线引导通过胫骨及股骨两隧道，先于股骨隧道外出口缝合、打结、嵌压于股骨隧道皮质外，于屈膝位30°拉紧，然后自关节腔内的两个骨道口注入杂合生物材料ICPCB或单纯ICPC材料0．5mL，再在胫骨侧缝线缝合收紧在胫骨隧道外口打结嵌压于胫骨隧道皮质外．空白对照组骨隧道内不注射材料，其他步骤均同生物材料治疗组，待材料凝固后，逐层关闭切口，消毒．术后实验动物膝关节外不施加固定，自由笼养．

1．3 动物术后康复训练模式及分组

21只行完手术实验兔麻醉清醒后笼内休息1天，术后第2天在持续被动康复训练仪上如图1所示．开始进行持续被动康复训练（Continuous Passive Motion；CPM）［9］．分为对照组（n＝7），ICPC治疗组（n＝7），ICPCB治疗组（n＝7）．具体的训练安排见表1．每次训练完后，实验兔双膝关节无任何束缚，笼内自由活动．康复训练持续8周后，处死实验动物进行相应检测分析．

表1 ACL术后持续被动康复训练具体安排Tab．1 Arrangement of continuous passive training after ACL reconstruction

1．4 显微CT（Micro-CT）检测

8周后处死动物取材，6例膝关节标本在行组织学检测之前，置于三维显微CT（Explore Locus SP，GE，USA）内进行扫描，扫描条件依照largetube＿14um＿150min＿ss规定，扫描结束后采用系统自带软件（Microview ABA2．1．2，GE）进行分析，主要观察腱-骨间新生骨组织．

图1 CPM训练仪Fig．1 Device for continuous passive motion training

1．5 组织学检测

6例膝关节取材后即刻以10%中性福尔马林液固定3天，行micro-CT检测后，梯度酒精（70%、90%、100%）脱水，聚丙烯酸甲酯（Polymethyl Metacrylate，PMMA）包埋，采用 Lieca SP 1600硬组织切片机垂直方向连续切片，切片厚度150～200μm，然后研磨抛光至（50±10）μm，作 Van-Gieson（V-G）染色后进行光学显微镜（DMLA，Leica）观察和图像分析．选用中心的3张连续切片观察材料体内骨组织长入及材料降解情况．

1．6 生物力学检测

8例膝关节标本除保留重建的前交叉韧带外，去除标本上的所有组织连接，将胫骨及股骨端分别固定于 AGS型（Shimadzu Corporation JAPAN）生物力学检测仪特定夹具两端，以50mm／min的垂直拉力进行牵拉试验至肌腱从骨隧道中脱出，此时的牵拉力为腱-骨结合部位所能承受的最大牵拉力（N）．

1．7 统计学分析

2 结果与分析

2．1 显微CT结果与分析

作为评价新生骨组织的指标，除组织矿含量（Tissue Mineral Content，TMC）显示新生骨组织的含量外，BV／TV （%）相对骨体积、Tb．Th（mm）骨小梁厚度、Tb．N （1／mm）骨小梁数量及 Tb．Sp（mm）骨小梁分离度这些指标提供了新生骨形态学方面的变化见表2，8周CPM训练后，ICPCB组TMC值以及BV／TV分数值明显高于对照组（P＜0．01）及ICPC组（P＜0．05）．

同时，表达界面内新生骨形态结构的其他指标ICPCB组也均优于对照组和ICPC组，该组界面新生骨组织显示具有较多小梁骨的形成，但骨小梁的分离度却很小．尽管骨小梁厚度与其他两组比较无统计学差异，然而数值仍然高于其他两组．

2．2 组织学结果与分析

如图2所示，8周CPM训练后，对照组腱-骨之间间距较大，仅观察到无规则的纤维血管组织．ICPC组中，腱-骨界面则主要观察到ICPC材料和少量新生软骨混杂，中间混绕着较多量纤维组织．在部分标本的界面内，可观察到在ICPC材料中夹杂着少量正在生长的新生骨．ICPCB组，界面则充填着大量新生骨，仅见小部分的ICPC材料碎片．尽管腱-骨界面之间的间距还存在，但是类似于sharpey’s纤维的簇状纤维连接着骨道与肌腱．

表2 显微CT检测结果Tab．2 Results of micro-CT scanning

图2 持续被动训练后各组腱-骨界面愈合情况（V-G染色 光镜下×100）Fig．2 The status of tendon-bone intecface healing after CPM

2．3 生物力学检测结果与分析

ICPC组和ICPCB组的最大牵拉力都明显地高于对照组（P＜0．05）．然而两组治疗组中，ICPC组腱-骨界面最大牵拉力高于ICPCB组．见表3．表3中＊与对照组相比显著性差异，P＜0．05；＊＊与对照组相比非常显著性差异，P＜0．01；▲与ICPC组相比显著性差异，P＜0．05；▲▲与对照组相比非常显著性差异，P＜0．01．

表3 最大牵拉力Tab．3 The maximum pulling load

3 讨 论

近年来，采用腘绳肌肌腱重建ACL手术由于避免了骨-髌腱-骨（Bone-Patellar Tendon-Bone，BPTB）重建手术的诸多不良作用而被临床医生广泛采用．但是不同于BPTB移植物，腘绳肌肌腱移植物两端无骨质结构，因而移植物两端往往采用固定器械以悬吊固定的方式固定于骨隧道出口两侧，固定点未在本身ACL的止点位置．这一术式导致移植肌腱-骨隧道界面可产生微动，这种微动有可能影响腱-骨界面之间的愈合，随之影响膝关节的稳定性［10-11］．

临床实践发现，ACL韧带重建后如果进行保守的康复计划，即进行至少6周的膝关节制动、限制关节周围肌肉收缩活动，可导致韧带、关节及周围肌肉功能障碍，因此术后早期进行相对于保守康复计划的激进的康复训练，例如早期的被动关节活动度练习有利于减轻疼痛，减少关节软骨不良反应，防止关节囊挛缩、关节粘连［12-13］．等速器械训练作为最常采用的训练是安全、有效的选择［14］．然而研究表明，激进的康复训练尽管减少了术后关节粘连等不良作用，缩短了术后重新参加运动的时间，但是其对于腱-骨界面愈合的负性作用也是不容忽视的，因为过激的运动可使界面的微动增加，移植肌腱与骨髓道之间的摩擦增加，无论是从力学或者关节内炎性介质角度考虑，都可能危害到界面的早期愈合，即移植肌腱与骨髓道之间的生物固定．

研究已确认，腱-骨界面愈合过程中骨向移植肌腱方向长入的过程起主要作用，而且骨的生长方式与骨折后愈合的方式相似，因此骨组织工程技术已被应用到促进ACL术后腱-骨界面的愈合［5］．注射型磷酸钙骨水泥（ICPC）由于其简便地注射性、体内常温即可凝固以及微创治疗模式的优势已被广泛应用于促进骨折的愈合，因而有学者将其应用于ACL术后腱-骨界面的愈合，结果显示其一方面可协助初始移植物的固定，增强移植肌腱与骨道之间的生物力学强度，最主要的是它可以促进界面新生骨的形成，从而促进了界面的愈合［3-4］．但是，很少有研究关注腱-骨界面注射入ICPC后伴随术后康复训练，尤其是在激进的康复训练过程后，界面的愈合是否仍旧被促进．本研究在腱-骨界面注入ICPC的同时术后应用类似临床实践的等速器械训练进行持续被动康复，设想通过这一举措可增强移植肌腱与骨道之间的黏着力，从而仍可发挥生物材料对于界面愈合的正性作用．

另一方面，前期实验发现加入内含BMP的RBX颗粒后，新形成的ICPCB杂合生物材料不仅提高了ICPC的孔隙率以及降解，而且其内含的BMP还会促进移植肌腱与骨道之间新生骨的形成，促进了界面的愈合．因此文中研究第二个设想将这种成骨效果优于ICPC的生物材料注入界面后，其阻止激进康复训练带来的负面影响效果可能会优于ICPC，可能会更有效地促进界面的进一步愈合．实验结果支持了实验最初的设想．实验动物进行完8周的持续被动CPM训练后，ICPC治疗组及ICPCB治疗组相较于对照组，都明显地促进了界面新生骨的形成．显微CT结果显示，ICPC的介入不仅增加了移植肌腱周围新生骨生成量以及小梁骨数量，而且也提高了新生骨的成熟度．作为具有骨传导功能的生物支架材料，单独的ICPC可以促进新生骨的形成，改善持续被动康复训练后腱-骨之间的愈合效果．并且，由于ICPC注入腱-骨界面初始形式是以泥状注入，可以与骨道有较好地黏着，固化后提高了移植肌腱与骨道之间的结合，这点可能减少腱-骨界面之间移植肌腱与骨道之间的微动，从而最小程度地减免了激进康复训练带来的不利作用．

为获得更好的界面愈合效果，前期学者的实验已经验证将BMP与ICPC直接混合可提高移植肌腱的骨融合．作为BMP的载体，ICPC完全符合其要求．但是在前期试验中发现由于ICPC的缓慢降解阻碍了腱-骨界面愈合的进程，因此在本研究中构建了具有良好孔隙率及降解速度，以及成骨效果的ICPCB杂合生物材料，并验证其可促进移植肌腱在骨道中达到更好的骨融合效果，并且明显好于单独的ICPC．分析其中原因，主要是此杂合生物材料构建过程．粘稠状的ICPC以液态形式与颗粒状的RBX骨粒均匀混合后，RBX类似人骨的天然多孔结构为ICPC造就多个大孔结构的同时，也造就了联系大孔结构间的交通孔，这样的三维孔隙结构为血管和新生骨组织的长入提供了有利的条件．另一方面，RBX作为天然的松质骨载体，不仅可有效的负载BMP，促进BMP作用的发挥，而且其内所含的胶原成分可延缓BMP的释放，维持局部BMP的有效浓度，对BMP的诱导活性有明显的协同促进作用．基于以上的优势，实验结果同样显示，ICPCB治疗组促进腱-骨界面之间成骨的效果仍优于ICPC的成骨效果．8周训练后，ICPCB组获得了高于ICPC组26%的新生骨容量以及高于ICPC组60%的小梁骨数量．这些结果均显示与ICPC单独应用相比，ICPCB杂合生物材料的介入对于降低激进康复训练带来的不利作用具有更好的优势．分析一方面RBX颗粒的引入不仅提高了ICPC的孔隙率及降解速度，而且RBX内含的BMP也提高了新生骨的生长速度．另一方面，ACL术后近关节腔侧的愈合由于内含炎性介质关节腔液的流入原因愈合较为缓慢，而激进康复训练势必带来关节腔液的过多分泌，而ICPCB构建首先是将BMP与脱钙的小牛松质骨混合和再与ICPC混合，不仅对BMP进行缓释，延长了BMP的作用时间，最重要的是，ICPC以及脱钙松质骨基质的包裹，避免了关节腔液对BMP作用的负性作用．

最初设想生物材料介入后腱-骨界面的生物力学结果明显应好于未治疗测．结果显示，8周康复训练后，ICPC或者ICPCB组最大牵拉力均明显高于对照组．但是，也观察到一个现象．显微CT和组织学结果显示，ICPCB组腱-骨界面均获得了较多新骨的生成，但是生物力学结果却显示最大牵拉力ICPCB组明显低于ICPC组．这一点不符合前期其他学者的研究结论，即腱-骨界面早期愈合的最大力量与骨长入的水平明显相关［15］．我们分析这可能主要与几个原因有关．首先，初始的生物力学性能ICPCB组由于RBX颗粒的加入而降低；再者，本实验设计中关注早期的愈合效果，因而愈合时间仅只有8周，新骨尽管生成量在ICPCB组较多，但是仍不成熟，伴随愈合时间的延长，这一结果可能会被改观．

4 结 论

上述研究显示无论是单纯的ICPC或者杂合的ICPCB均能够在ACL术后激进康复训练过程中阻止训练带来的负性作用，促进腱-骨界面的愈合．但杂合型生物材料ICPCB由于生长因子BMP以及多孔隙结构存在，使得其促进愈合的效果明显优于单纯的ICPC．然而对于其具体的作用机制仍有待深入探讨．

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