蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因克隆与表达研究进展

路海博 孙元元 汤海港 张蕴薇

摘 要 蔗糖是植物中重要的代谢产物，它直接或间接参与多种生理生化反应，研究其含量的变化规律对提高植物生物学产量和增强植物抗逆性具有重要的指导意义。蔗糖磷酸合成酶（SPS）是蔗糖代谢的关键酶之一，它催化蔗糖代谢中的限速反应，SPS基因在分子水平编码调控SPS。研究SPS基因克隆与表达规律是从分子水平揭示蔗糖代谢的基础。本文综述了近年来SPS基因克隆和表达研究进展，并展望了SPS基因的研究前景和应用前景。

关键词 蔗糖 ；蔗糖磷酸合成酶基因 ；克隆 ；表达

分类号 Q943.2

蔗糖是高等植物光合作用的主要产物[1]，是碳运输的主要形式，也是“库”代谢的主要基质，蔗糖转移效率[2]直接决定植物生长快慢；蔗糖参与植物渗透调节，环境胁迫下植物会大量合成蔗糖，提高细胞液浓度，阻止细胞质过度失水；蔗糖通过反馈作用调节一些酶的活性，也可作为信号因子诱导或阻碍某些基因的表达。与蔗糖代谢相关的酶[3-4]有蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthetase， SPS）、蔗糖合成酶（sucrose synthetase， SuSy）和转化酶（invertase， INV）。在这3种蔗糖代谢酶中，SPS是最重要的限速酶，它直接调控植物中蔗糖和淀粉的合成与分配，是催化蔗糖合成的主要酶[5]。

植物体内蔗糖的积累与SPS活性正相关。已有研究表明，蔗糖是甜高粱[6]茎秆中糖分积累的主要形式，约占总含糖量的85%。甜高粱茎秆蔗糖含量与叶SPS蛋白质的表达相关系数为0.895，与茎秆SPS蛋白质的表达相关系数为0.781。比较高梁和甜高粱，随着高粱的生长发育，SPS-A在茎秆中的表达不断增强，与蔗糖积累增加趋势一致。在生长后期，甜高粱茎秆中SPS-A表达量明显高于普通高粱，这可能就是甜高粱蔗糖丰富积累的关键，表明高粱茎秆蔗糖积累[7]与SPS-A在茎秆中的表达相关。

SPS蛋白水平研究相对成熟，结构、性质、活性调控[8-9]都已有报道。SPS广泛存在于植物光合组织和非光合组织中，是一种低丰度、可溶性、不稳定蛋白，酶活最适pH值约为7.0，由分子量117～138 kD的亚基构成为二聚体或四聚体。SPS在植物体内催化UDPG和F-6-P（6-磷酸果糖）反应生成G-6-P（6-磷酸葡萄糖）和UDP，G-6-P又在蔗糖-6-磷酸合成酶（SPP）作用下迅速降解为蔗糖和磷酸根离子，使得SPS催化的蔗糖合成反应实际上是不可逆的[10]。6-磷酸葡糖共价调控SPS活性，无机磷抑制SPS活性。另外，光照和渗透压变化因为改变氧化磷酸化位点上的丝氨酸残基也会影响SPS的活性[11]。

SPS基因在基因水平直接编码调控SPS，SPS基因的分子生物学研究近年来取得了一系列进展。克隆与表达分析一直是分子生物学的重要组分，本文对SPS基因的克隆与表达分析展开综述，为对该基因的进一步研究提供参考。

1 SPS基因克隆研究进展

1.1 SPS基因克隆方法

植物基因克隆方法相对成熟，主要有功能克隆，PCR扩增，转座子或T-DNA标签，定位克隆，差别杂交和减法杂交，mRNA差异显示和人工合成克隆[12]等多种方法。目前，获得SPS基因克隆最常用的、报道最多的方法是PCR扩增克隆法[13]。通过参考已知基因序列，从GenBank中下载保守序列，设计特异引物或简并引物，以RNA反转录的cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下获得特定DNA片段。这是一种快速简便基因克隆方法。

Guangming Sun[14]等使用PCR扩增法从菠萝中克隆了一个1 132 bp的SPS基因片段AC-SPS1。AC-SPS1基因属于A家族，编码377个氨基酸残基，含有两个丝氨酸特征残基。除了设计特异性引物，还可以利用保守氨基酸序列设计简并引物。通过设计简并引物，获得了菠萝[15]中1 131 bp的不同家族SPS基因片段，其编码的氨基酸序列与水稻、翠竹、高粱、小麦的SPS氨基酸序列同源性分别达到了85%、84%、82%和81%。

1.2 SPS基因克隆进展

SPS基因序列具有多样性。Castleden[16]等人对已知的SPS基因序列进行分析，界定了植物SPS基因的4个大家族（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ或者A、B、C、D）。依据这一标准，单子叶和双子叶植物中广泛存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个基因家族，而Ⅳ家族（包括Ⅳ1和Ⅳ2）基因家族到目前为止只在禾本科植物中发现。在模式植物拟南芥中有4个SPS基因。其中2个基因位于5号染色体上，属于家族A。1个基因位于1号染色体上，属于家族B。1个基因位于4号染色体上，属于家族C。现在发现的D家族SPS基因比较特殊，它编码的SPS蛋白N末端和C末端的氨基酸残基数要比A、B、C家族少80～90个。

不同SPS基因家族在不同的器官组织中相对含量是不尽相同的，它们所发挥的功能也存在差异。通过RNA干扰抑制烟草叶片SPS-A基因和SPS-C基因的表达，发现在缺乏SPS-C的情况下，淀粉不能被有效动员降解而合成蔗糖，说明SPS-C与淀粉降解后蔗糖的合成密切相关，SPS-A存在于所有组织，抑制SPS-A没有观察到明显的表型变化[17]。所以克隆不同植物不同家族的SPS基因具有重要意义。

SPS基因首先在玉米中得以克隆[18]，之后在菠菜、甜菜、柑桔、蚕豆、水稻、甘蔗等多种作物中相继克隆出来[19-21]。截止目前，在NCBI中检索SPS基因，可以获得83条核酸序列。其中可可树SPS核酸序列GenBank中收录最多，有7条。GenBank收录SPS基因序列物种分布情况如图1所示。

基因克隆是分子生物学的重要组成，是物种中存在特定基因的重要证据，是基因功能研究的基础。不同植物中SPS基因数目不同。甘蔗属于禾本科的单子叶植物，所以甘蔗基因组中至少有5个分别属于5个不同家族的SPS基因。目前在甘蔗[22-23]中，已鉴定了3个SPS基因（GenBank登录号分别为：AB001337、EU269038和AB001338），其中2个已获得全长氨基酸序列（EU269038和AB001338），分别属于A家族D家族。何文锦等2007年从甘蔗叶片中克隆了SOSPS2，cDNA长 3 013 bp，其中第59-2 953位是该基因的开放阅读框，编码964个氨基酸。叶冰莹[24]等2011年通过反转录PCR技术分离克隆了SPS基因cDNA片段，序列分析表明，该cDNA片段包含1个3 183 bp的开放阅读框，可编码1 060个氨基酸。已克隆的甘蔗SPSⅢ基因有2个等位变异类型SPSⅢ-1和SPSⅢ-2，同源性达99%。亲缘关系较近的，高粱属的甜高粱——同为茎秆含糖量较高的物种，已克隆出全长DNA序列SPS3-1[25]。

在原核生物蓝藻中存在光合作用，光合产物以蔗糖的形式转运。John E. Lunn[26]等在蓝藻中克隆到一个SPS基因，包含2 163 bp的ORF序列，将该基因编码的氨基酸序列和高等植物的SPS氨基酸序列进行比对，表现出了35%～39%的同源性。表1列出了几种重要植物中获得的SPS基因序列信息以及它们和不同物种同源性比对结果。

2 SPS基因表达研究进展

2.1 SPS基因表达研究方法

植物的生长、发育是基因差异表达的结果，研究基因表达有实时荧光定量PCR、半荧光定量PCR、印记杂交、原位杂交等方法。关于SPS基因表达研究的文献报道中，使用最多的是实时荧光定量PCR和印记杂交技术。

2.1.1 实时荧光定量PCR

在PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法为实时荧光定量PCR技术[33]。该方法具有简便、快速、高效等特点，在基因表达研究中广泛应用。

在水稻[34]中，Naohiro Aokia等实时荧光定量PCR技术研究了5个SPS同源基因的表达特性。SPS1基因在源组织中大量表达，而SPS2、SPS6和SPS8基因在源、库组织中等量表达。5个同源基因SPS1、SPS2、SPS6、SPS8和SPS11的差异表达决定了水稻在萌发期、苗期、抽穗期的发育特征。C P L Grof使用相同方法测定了5种SPS基因家族在甘蔗[35]中的表达规律，SPS基因B、C家族在未成熟叶和成熟叶中均大量表达，D1、D2家族在茎、叶等量表达，A家族在叶中表达水平较低。陈由强等研究了甘蔗中SPSⅡ基因在糖分积累不同时期表达量的变化规律。在糖分积累初期，SPSⅡ基因在茎中大量表达；在糖分积累中期，SPSⅡ基因在叶中大量表达。枸杞是茄科多年生灌木，蔗糖含量对其品质起重要作用。王丽娟等[36]用实时荧光定量PCR技术研究了枸杞中SPS基因的表达规律，在枸杞花和果实中SPS基因表达量高，而在根和叶中表达量低。文心兰在开花过程中SPS基因会大量表达，甜瓜根中SPS基因表达量低，枸杞花、根中SPS基因表达研究结果和文心兰、甜瓜相关研究结果一致。采用荧光定量PCR技术分析巴西橡胶树[37]中SPS基因的表达模式，胶乳中表达量最高，树皮、叶、花、种子、根中表达均较低。

2.1.2 印记杂交技术

在基因操作中，把DNA或RNA、蛋白质等在薄膜滤器上经浸润、固定后，于薄膜滤器上进行杂交，生成杂种分子的过程称为印记杂交[38]。分析RNA的Northern blot、分析DNA的Southern blot、分析蛋白的Western blot技术在实时荧光定量PCR普及之前都广泛用于基因表达分析。

Chengchao Zheng 利用Northern blot技术分析了CmSPS1基因在甜瓜中的表达情况：在叶、茎、成熟果实中都有CmSPS1基因表达，但是在根和花中没有检测到mRNA。对菠菜[39]根、叶柄叶片进行Western blot和 Northern blot 分析，发现SPS基因主要在叶中表达，在叶片快速生长的初期大量积累。Southern blot分析柑橘[40]CitSPS1基因，发现它一个低拷贝基因。暗处理玉米[41]12 h后，Northern blot 分析表明SPS基因的转录水平显著下降。

2.2 SPS基因表达的空间特异性和时间特异性

空间特异性也称组织特异性或细胞特异性，在植物生长发育过程中，SPS基因表达按照不同组织空间顺序出现，并且在不同组织中呈现不同的规律。时间特异性是指在植物不同功能需求的生长发育各个阶段，SPS基因表达按特定的时间顺序发生，基因表达量也随时间顺序发生变化。基因表达空间特异性和时间特异性均是不可逆的。

2.2.1 SPS基因表达的空间特异性

提取复活草根、叶组织的RNA，和特异性基因探针杂交，发现CpSPS2只在叶中表达，而CpSPS1在根、叶中都有表达，且CpSPS1转录丰度明显高于CpSPS2。在温州蜜桔所有器官中都有CitSPS1基因的转录，但是在幼叶、花和未成熟的果实中转录水平很低，在老叶和成熟果实中转录水平很高。甘蔗中基因表达分析表明，不同部位SPS基因表达量有差异，茎组织中SPSⅡ表达量占SPS基因转录总量的40%。甜菜[42]中，BvSPS1基因是一个低拷贝基因，主根中BvSPS1基因的转录水平高于叶中。SoSPS1基因在甘蔗[43]叶中大量表达，SoSPS2基因不仅在叶中还在根中表达，且转录水平相近。水稻[44]SPS1基因只在叶中表达，而不在根中表达。Champa Sengupta-Gopalan等研究了苜蓿[45]叶片和根中3个SPS基因的表达规律，一个属于A家族（MsSPSA），2个属于B家族（MsSPSB和MsSPSB3），MsSPSA基因在节间表达增强，MsSPSB基因和MsSPSB3基因在叶中表达增强。

从以上报道中可以发现，大部分植物根中SPS基因表达水平较低，这可能是因为根中不发生光合反应，没有光合产物在根中合成蔗糖造成的；而在含糖量高的植物器官中，SPS基因表达水平较高，如巴西橡胶树胶乳、温州蜜橘果实、甘蔗茎杆中等等。

2.2.2 SPS基因表达的时间特异性

菠萝成熟过程中SPS酶活不断增强，在SPS催化下，蔗糖含量不断增加，单糖含量不断下降。在果实发育早期，SPS基因的表达量很低，授粉后20 d表达量开始增加，并在授粉后70 d达到顶峰，转录水平变化趋势和酶活力变化趋势相同。SPS酶活和蔗糖含量在授粉后80 d达到最大，比SPS基因转录峰值晚10 d左右。这些实验结果表明，SPS基因的转录水平和SPS酶活确实存在一定相关性。甜瓜授粉25 d后检测到CmSPS1基因表达，果实成熟时基因表达量达到峰值。甜瓜授粉30 d后SPS酶活开始增加，蔗糖积累开始增加。SPS基因表达和甜瓜SPS酶活力变化也存在一定相关性。在温州蜜桔果实中3个SPS基因CitSPS1，CitSPS2和CitSPS3独立表达调控。CitSPS1基因在果实发育全程都会表达，果实成熟阶段（开花后223 d）表达量达到峰值，开花后178 d CitSPS2基因开始表达，CitSPS3基因在果实发育过程中都不表达。这些报道表明，在植物蔗糖含量大量增加的生长发育阶段，SPS基因大量表达，且基因表达量峰值出现的时间早于蔗糖含量峰值出现的时间。这可能是因为SPS基因需要一定时间转录mRNA并翻译成SPS才能发挥作用并影响植物的生理、生化过程。

2.3 非生物因素对SPS基因表达的影响

在特定环境下，非生物因素会对植物生长造成影响。SPS不仅是植物蔗糖代谢中的关键酶，还在植物生长发育过程中发挥着多方面生物学功能，如参与植物的抗逆生理。已有研究发现SPS在抗寒、抗旱等生理过程中起重要作用[46]。在非生物因素处理下SPS基因的表达也会发生变化，且这种变化是可逆的（表2）。

Dorothea Bartels干旱处理复活草叶片，发现新鲜叶片脱水初期SPS基因的转录水平会增加，随着干燥程度增加，SPS基因会降低到一个极低的转录水平，SPS基因转录水平会在叶片复水后24 h内逐渐恢复。Dibyendu N. Sengupta研究了3个香蕉[47]品种Cavendish，Kanthali和 Monthan成熟过程中乙烯处理对SPS基因表达的影响。不同品种对乙烯的敏感程度不同。乙烯处理Cavendish后，SPS基因的转录水平大量上调，Kanthali乙烯处理后，SPS基因转录水平温和上调，而Monthan品种整个成熟过程中SPS基因转录都维持在一个较低的水平，且乙烯处理也没有刺激SPS基因转录水平的上调。2008年Dibyendu N. Sengupta又报道了香蕉[48]在生长素、伤害、低温处理下SPS基因转录水平的变化。生长素和低温处理轻微增加了SPS基因的转录水平，而伤害处理降低了其转录水平。

非生物因素对SPS基因表达的影响主要表现在2个方面：当非生物因素变化使植物蔗糖合成增加时，SPS基因表达会上调。如增强植物光合作用或者提高培养基葡萄糖含量，在干旱、低温等胁迫处理下蔗糖合成也会增加，蔗糖会作为信号转导因子传递胁迫信号并诱导植物发生特定生理生化过程来适应环境变化；另一方面，当胁迫压力持续过大影响到植物正常代谢活动时，SPS基因表达就会迅速降低。

3 展望

3.1 SPS基因在蔗糖代谢中的研究前景

尽管许多研究都表明SPS基因确实参与了植物蔗糖代谢，但是蔗糖代谢过程极其复杂，中间涉及多种基因的相互作用。在桃中，已经发现6种非同源基因[49]参与了蔗糖代谢，在这些基因中，SPS基因研究最深入，未来将会更精确的定位其在植物蔗糖代谢通路中发挥的作用。SPS基因被认为是最有发展前景的蔗糖代谢相关基因之一。

蔗糖含量、蔗糖代谢酶活性、蔗糖代谢基因转录水平三者之间的动态变化规律一直是研究热点。现在很多植物中都有了报道，但还缺乏系统认识，仍然需要在更多的植物中开展相关研究。SPS是重要的蔗糖代谢酶，过去SPS研究多集中在蛋白水平，未来将会更深入研究SPS基因，探索SPS基因的表达规律并通过转基因技术对其进行功能验证。

3.2 SPS基因的应用前景

全球能源危机也日趋严重，清洁可再生的生物质能源应用前景广阔，但是一直受到原料转化率低的限制。提高生物质能源原料中蔗糖含量无疑是提高原料转化率有效且可行的办法之一。SPS基因是植物蔗糖代谢中的一个重要基因[50]，可能是提高植物中蔗糖含量的关键基因。对SPS基因进行更深入研究并通过转基因技术提高生物质能源原料中蔗糖含量可以突破原料转化率低这一限制生物质能源利用的瓶颈，SPS基因应用前景非常广阔。

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