改性秸秆载体固定化微生物修复石油污染土壤

张秀霞，武海杰，韩雨彤，郭云霞，张守娟

（中国石油大学 环境与安全工程系，山东 青岛 266580）

随着石油开采的加速，石油烃类物质对环境的污染日益严重，尤其是“跑冒滴漏”引起的土壤石油污染正威胁着人们的生产、生活。目前，生物法是处理石油污染土壤最经济有效的方法之一，而固定化微生物技术由于处理效率高、易保持微生物活性等优点而应用广泛。对于石油污染土壤的处理，固定化微生物技术明显优于游离微生物修复土壤的效果［1－3］；吸附法制备固定化微生物，因操作简单、细胞活性损失小而得到了广泛应用，但存在微生物与载体结合不牢、容易脱落以及易达到吸附饱和的缺陷。载体的比表面积和孔结构等表面物理特性和表面化学特性影响到固定化效率［4］，通过改性可以改变载体表面官能团的种类和数量［5］，从而改变载体的化学吸附［6］、亲水性以及疏水性。

目前，国内外学者［7－8］通过改变载体材料的物理化学结构来提高载体材料的吸附性能，提高对废水中有机物、阴阳离子以及重金属的去除效率，载体表面的含氧官能团如羟基、羧基和内酯基有利于固定微生物，提高微生物的吸附能力以及结合强度［9－10］。

实验采用硝酸、硫酸、乙酸和硼酸等对秸秆材料XMG进行改性，以增加XMG表面酸性官能团含量，提高载体对微生物的吸附量，再采用改性XMG吸附法制备固定化微生物，应用于石油污染土壤的修复，考察改性XMG固定化微生物的修复效果，为石油污染土壤的生物修复提供理论指导。

1 实验方法

1.1 材料

供试土壤采自新疆克拉玛依油田的风城作业区，pH值范围7.2～7.4，含水率范围7%～9%（质量分数），有机质质量分数范围23.7～35.8g/kg，全氮量范围14.7～19.8g/kg，有效磷质量分数范围14.9～19.8g/kg，石油烃质量分数范围3.4%～4.7%。供试土壤去除植物残体以及砾石过3mm筛，经自然风干7d后使用。

1.2 富集培养基

牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，pH 值7.0～7.2，121℃灭菌20min。

1.3 实验方法

1.3.1 XMG的酸性氧化改性

分别用一定浓度硝酸、硫酸、硼酸和乙酸作为改性剂，在一定温度下改性秸秆XMG一定时间。用蒸馏水将XMG洗至中性，烘干后用于测定XMG表面的酸性官能团、碱性官能团含量，用作载体材料制备固定化微生物。

1.3.2 XMG吸附微生物量的测定

采用光密度OD600间接表示XMG吸附微生物量［11］。向活化12h的50mL菌液中投加40目0.5g的XMG，在30℃、160r/min的摇床中固定微生物。12h后，将锥形瓶取出静置一段时间倒掉上清液，用生理盐水将XMG转移至50mL离心管中（不晃动），1000r/min下离心分离5min。取出后倒掉上层清液，重复3次；加入约10mL生理盐水于离心管中（剧烈振荡），1000r/min下离心分离5min，将上层液体过滤至50mL容量瓶，重复3次；用生理盐水将滤液定容至50mL，摇匀，采用721分光光度计在600nm处测定其OD600值。

1.3.3 XMG表面官能团的测定方法

采用Boehm法［12］测定XMG表面羧基、内酯基、羟基官能团和碱性官能团。

2 结果与讨论

2.1 改性条件对改性XMG吸菌性能的影响

2.1.1 改性剂浓度的影响

使用硝酸、硫酸、硼酸和乙酸为不同的改性剂，15℃时，分别在0、1、5、10和15mol/L浓度下，对XMG改性60min，考察改性剂浓度对改性XMG吸菌性能的影响，结果示于图1。

图1 改性剂浓度（c（Modifier））对改性XMG吸菌量（OD600）的影响Fig.1 The effect of modifier concentration（c（Modifier））on modified XMG bacteria uptake（OD600）

由图1可知，随着酸浓度的增加，改性XMG的吸菌量（即OD600）呈现先增大后减小的趋势。硝酸、硫酸、乙酸、硼酸摩尔浓度分别为5、5、10和5mol/L时，改性XMG的OD600达到最大值。

酸改性可增加秸秆表面羧基、羟基的含量，同时酸改性秸秆能够去除秸秆表面的灰质、中和秸秆表面碱性官能团［13］含量，因此在一定浓度范围内，酸浓度越高，越有利于活性基团的增加；同时，带有氨基、羧基和羟基等反应性基团的大孔载体在固定化微生物过程中会与微生物发生键合，从而提高了固定化微生物的吸附量和稳定性［14］，因此随着酸浓度的增加，改性XMG的吸菌量呈现增加的趋势。随着酸浓度的继续增加，改性XMG的吸菌量呈现下降的趋势，这可能是由于高浓度的酸破坏了XMG原有成分，从而不利于吸附微生物［15］。

2.1.2 改性时间的影响

在室温15℃下，分别采用5mol/L的硝酸、5mol/L的硫酸、10mol/L的乙酸和5mol/L的硼酸对XMG改性，改性时间分别为0、30、60、90、120min，考察改性时间对改性XMG吸菌性能的影响，结果示于图2。

图2 改性时间（t（Modification））对改性XMG吸菌量（OD600）的影响Fig.2 The effect of t（Modification）on modified XMG bacteria uptake（OD600）

由图2可知，对于4种酸改性的XMG，随着改性时间的延长，其吸菌量呈现先增大后减小的趋势。5mol/L的硝酸、5mol/L的硫酸、10mol/L的乙酸和5mol/L的硼酸分别在改性时间为60min、60min、30min和30min时，改性XMG的吸菌量达到最大值。

秸秆材料通常具有水溶性差、反应活性不足等缺点，通过适当的改性会破坏原有的有序结构并引进新的功能基团，使其反应活性增强［16］。采用酸改性秸秆材料，秸秆材料表面总碱度随着改性时间的延长而降低，同时总酸度随着改性时间的延长而增加，有利于吸附固定化微生物的表面官能团更多地暴露在表面，更容易吸附微生物［13］，因此随着改性时间的延长，改性XMG吸菌量呈现增加的趋势；随着改性时间的继续延长，改性XMG吸菌量有降低的趋势，这可能是因为改性时间过长使得XMG的比表面积和孔径发生了变化，从而不利于吸附微生物。

2.1.3 改性温度的影响

分别在15、30、50、70和100℃下，采用5mol/L的硝酸改性60min、5mol/L的硫酸改性60min、10mol/L的乙酸改性30min和5mol/L的硼酸改性30min，考察改性温度对改性XMG吸菌性能的影响，结果示于图3。

图3 改性温度（T）对改性XMG吸菌量（OD600）的影响Fig.3 The effect of modification temperature（T）on modified XMG bacteria uptake（OD600）

由图3可知，随着改性温度的升高，改性XMG吸菌量呈现先增大后减小的趋势。在70℃下，5mol/L的硝酸改性60min、5mol/L的硫酸改性60min、5mol/L的硼酸改性30min及10mol/L的乙酸在30℃下改性30min时，改性XMG的吸菌量分别达到其最大值；温度对硝酸改性XMG和硫酸改性XMG的影响不大，故采用硫酸和硝酸改性XMG时可在室温15℃下进行。酸改性秸秆材料实质上是秸秆材料水解的过程，水解过程有利于引进新的功能基团［17］，故温度越高，越有利于增加秸秆表面活性基团的数量，与兰培等［18］关于高温有利于增加表面酸性官能团的实验结果一致。随着温度的继续升高，改性XMG吸菌量有下降的趋势，这是因为XMG中纤维素、半纤维素和木质素的水解温度不同，若超过纤维素的水解温度［19］，纤维素发生水解，则会损失吸附菌的活性基团，导致吸菌量的下降。

由上述结果可以得到秸秆XMG的最佳改性条件，分别为5mol/L的硝酸在室温15℃下改性60min、5mol/L的硫酸在室温15℃下改性60min、10mol/L的乙酸在70℃下改性30min和5mol/L的硼酸在30℃下改性30min。

2.2 最佳改性条件下改性后XMG的吸菌性能和表面性质

2.2.1 表面化学组成和吸菌性能

最佳改性条件下得到的4种改性XMG的表面官能团含量和吸菌量列于表1。

表1 最佳改性条件下得到的4种改性XMG的表面官能团含量和吸菌量Table 1 The content of surface functional groups and bacteria uptake of modified XMG obtained under optimal modification conditions

由表1可知，在最优改性条件下得到的4种改性XMG的酸性官能团含量整体上高于未改性XMG，碱性官能团含量低于未改性XMG；其中，乙酸改性XMG的酸性官能团含量（如羧基、羟基和内酯基）相对较高、碱性官能团含量相对较少。改性XMG吸菌量整体上高于未改性XMG，且乙酸改性XMG吸菌量明显高于其他改性方法得到的XMG吸菌量。综合表面官能团和吸菌量的变化，以10mol/L的乙酸在70℃下改性30min得到的改性XMG为最佳的改性XMG载体。

由表1还可以看出，改性XMG的羧基、羟基和内酯基的含量增多。Yang等［20］的实验表明，羧基和羟基含量的增加在一定程度上提高了秸秆的极性，从而更有利于微生物的固定化，与周林成等［14］关于微生物固定化的影响因素研究具有一致性。同时，酸改性减少了XMG表面灰分含量、中和了表面部分碱性官能团，且改性时间越长，其表面碱性官能团含量越少，而碱性官能团不利于吸附固定化微生物［10］，因此酸改性可以增强XMG的吸菌性能；乙酸改性XMG吸菌量最大，这与乙酸改性XMG的官能团含量变化具有一致性，是由于XMG在吸附微生物时通过物理吸附极容易达到吸附饱和，而通过酸性官能团固定微生物占主要部分，对吸附微生物起着重要的作用。

2.2.2 表面物理结构

对以10mol/L的乙酸在70℃下改性30min得到的最佳改性XMG进行SEM分析，探究XMG的吸菌性能和其物理结构的关系，并与未改性秸秆XMG对照，结果示于图4。

图4 最佳改性XMG样品和未改性XMG的SEM照片Fig.4 SEM images of XMG and optimal modified XMG sample（a）Modified XMG；（b）XMG

由图4可知，改性前XMG表面比较规则、平整且致密，改性后XMG的表面粗糙，结构较为疏松，出现了发达的孔隙结构，这样的结构为微生物的固着提供了有力的条件，同时易于吸附微生物分泌的酶、辅酶或石油烃污染物，从结构上表明改性XMG比未改性XMG能够吸附更多的微生物，与表1的结果具有一致性。

2.3 改性秸秆XMG固定化微生物修复石油污染土壤

以10mol/L的乙酸在70℃下改性30min得到的改性XMG作为载体材料，采用吸附法制备固定化微生物用于修复石油污染土壤，调整石油污染土壤的C、N、P质量比为100∶10∶1、含水率为20%、翻耕频率为1次/d，并以未改性XMG固定化微生物、游离微生物和土著微生物修复相同土壤为对照，结果示于图5。

图5 采用各种微生物修复石油污染土壤的石油降解率随时间的变化Fig.5 The oil degradation rate of petroleum contaminated soil by different microbials vs time

由图5可以看出，石油降解菌的投加明显提高了石油降解的速率。降解35d，加入高效石油降解菌的土样，石油降解率从18.2%升至30.3%，固定化微生物的石油降解率比游离微生物的高，达40.6%，改性XMG固定化微生物修复效果稍高于未改性XMG固定化微生物，石油降解率提高到42.9%。改性XMG固定化微生物和未改性XMG固定化微生物其修复效果在修复初始阶段效果相差不大，这是因为在初始阶段主要进行微生物的增殖，二者在本质上没有太大的区别，都是多孔的有机载体材料，为微生物提供一个良好的附着体和微环境的缓冲体系［21］。乙酸改性XMG吸菌量比未改性XMG有明显的增多（见表1），但二者的石油降解率相差不多。这可能是因为，一方面酸的处理增加了XMG表面官能团的数量使其更有利于吸附微生物，但不利于吸附疏水性的石油烃类物质；另一方面酸的处理可能破坏了XMG本身的多孔结构，使得XMG吸附和微生物降解的协同作用［22］出现了阻力，结果使二者的石油降解率相近。

3 结 论

（1）秸秆XMG最佳改性条件为10mol/L的乙酸在70℃下改性30min。在该条件获得的改性XMG，其酸性官能团中羟基摩尔浓度从改性前的0.08mmol/L增至0.19mmol/L、内酯基摩尔浓度从0.34mmol/L增至1.28mmol/L、羟基摩尔浓度从0.12mmol/L增至1.07mmol/L，吸菌量从0.209增至0.297，表明改性XMG有利于吸附微生物。

（2）对石油污染土壤进行35d修复，固定化微生物的修复效果明显强于游离微生物和土著微生物，而改性XMG固定化微生物的修复效果比未改性XMG固定化微生物修复效果略有提高，石油降解率从40.6%提高到42.9%。

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