不同时期增生性瘢痕组织中前列腺素和基质金属蛋白酶—2的含量测定及分析

袁志坚+++++周梅芳++++++何文涓++++++吴华英++++++赵庆国

[摘要] 目的 测定不同时期烧伤患者增生性瘢痕（HS）组织中前列腺素（PGs）和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的含量并探讨其变化规律。 方法 选取2013年3～9月在无锡市第三人民医院收治的烧伤患者或需手术切除瘢痕的患者皮肤标本57例，分为正常组（10例），烧伤早期组（9例），瘢痕1个月组（9例）、3个月组（9例）、6个月组（8例）、12个月组（6例）、24个月组（6例）。采用ELISA法和Western bolt法测定不同时期各分组瘢痕组织中PGs（包括PGD2，PGE2和PGF2α）和MMP-2含量。观察PGs和MMP-2在不同时期瘢痕组织中的含量变化。 结果 正常组PGE2、PGD2和PGF2α的含量最低[（5.543±0.484）、（3.619±0.484）、（4.833±1.106）ng/mL]，与正常组比较，烧伤早期组PGE2、PGD2和PGF2α含量显著增加[（30.960±0.735）、（25.952±1.309）、（17.451±1.056）ng/mL]（P < 0.01）；除正常组外，瘢痕24个月组PGE2、PGD2和PGF2α的含量最低[（11.445±0.972）、（8.012±0.972）、（5.888±1.059）ng/mL]，但与正常组比较差异仍有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。MMP-2在正常组含量最低，与正常组比较，烧伤早期组MMP-2的增加（P < 0.05），瘢痕3个月组含量最高（P < 0.01），瘢痕12个月组降低（P < 0.05），瘢痕24个月组MMP-2含量则降低至与正常组接近的水平（P > 0.05）。 结论 PGs和MMP-2在不同时期瘢痕组织中的含量和正常皮肤比较有显著差异，提示两者可能在增生性瘢痕中有重要作用。

[关键词] 增生性瘢痕；前列腺素E2；前列腺素D2；前列腺素F2α；基质金属蛋白酶-2

[中图分类号] R62 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）12（a）-0015-04

增生性瘢痕（hyperplastic scar，HS）多发生于深度烧伤的创面愈合后。由于瘢痕组织的黏弹性降低，使人体表面皮肤组织的正常解剖结构遭到破坏，从而导致功能障碍，影响正常的生活与工作，给患者带来极大的心理负担[1]。皮肤创伤愈合经历3个阶段，即炎症期、肉芽组织形成期和瘢痕形成期。这3个阶段是连续并相互联系、相互重迭的[2]。创伤愈合过程中的炎性反应，一方面可以作为抗感染的免疫屏障，一方面刺激纤维形成以闭合创面[3]。前列腺素（prostaglandins，PGs）是这其中一种常见的炎症介质，可介导炎症的发生和发展。皮肤能合成、降解PGs。多种皮肤病与PGs及其衍生物有关[4-5]。正常情况下，伤口内的胶原合成与分解呈动态平衡，在某些情况下，这种平衡被打破，导致成纤维肌纤维母细胞合成胶原增多，而胶原纤维分解减少，胶原合成速度远大于胶原分解，最终导致了胶原沉积，从而形成瘢痕组织[6]。这一演化过程包括创面中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分和定位的改变，而细胞外基质持续的降解和重建过程又受到基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的调控[7]。MMPs是影响细胞外基质降解的关键性蛋白水解酶，它主要由角质形成细胞巨噬细胞成纤维细胞内皮细胞等细胞分泌。目前已知MMPs主要有20多种[8]，其中基质金属蛋白酶-2（matrix metalloprotein-2，MMP-2）属于明胶酶，主要水解底物为变性胶原和细胞外基质的主要成分，如Ⅳ型胶原和Ⅴ型胶原等，在创伤愈合中具有重要的作用[9]。PGs和MMP-2都参与了瘢痕的形成过程，而在不同时期瘢痕组织中PGs[包括前列腺素D2（PGD2）、前列腺素E2（PGE2）和前列腺素F2α（PGF2α）]和MMP-2的含量变化的相关报道较少。本研究采用ELISA法和Western bolt法观察了不同时期瘢痕组织中PGs和MMPs的表达。为进一步研究MMP-2和PGs在瘢痕组织中的作用和机制提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

主要试剂：苯甲基磺酰氟（ST506），RIPA裂解液（P0013C），超敏ECL化学发光试剂盒 （P0018），BCA蛋白定量试剂盒 （P0010），SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 （P0012A）均购于碧云天公司。一抗（bs-4605R）兔抗人MMP-2单克隆抗体，二抗（bsF-0412R）购于北京博奥森生物技术有限公司。PGD2试剂盒（512031-96），PGE2试剂盒（514010-96），PGF2α试剂盒（516011-96）均购于Cayman Chemical公司。

主要仪器：液氮罐（河南天驰仪器有限公司）；玻璃匀浆器（上海生工）；TG-1650WS型离心机（上海卢湘仪）；BioTek酶联免疫分析仪（美国伯腾仪器有限公司）；Bio-Rad电泳仪（伯乐生命医学产品上海有限公司）；Mini Protean 3垂直电泳槽（伯乐生命医学产品上海有限公司）；曝光仪（上海天能科技有限公司）；TY-80B脱色摇床（普阳科学仪器研究所）。

1.2 标本来源

瘢痕组织和正常皮肤组织标本均取于2013年3～9月在无锡市第三人民医院整形科收治的烧伤患者或需手术切除瘢痕的患者，共57例。按时期不同将标本分为7组，其中，烧伤早期组（烧伤后5 h～2 d）9例，瘢痕形成后1个月组（瘢痕1个月组）9例，瘢痕形成后3个月组（瘢痕3个月组）9例，瘢痕形成后6个月组（瘢痕6个月组）8例，瘢痕形成后12个月组（瘢痕12个月组）6例，瘢痕形成后24个月组（瘢痕24个月组）6例，取上述患者中10例瘢痕患者的正常皮肤组织作为正常组。所有取材部位未经任何治疗，标本经无菌取材后，液氮冻存备用。

1.3 实验方法

1.3.1 不同时期瘢痕组织中PGs含量的检测 本实验测的PGs包括PGD2，PGE2和PGF2α，均用试剂盒检测。PGD2的具体检测过程如下：取冻存的组织标本，按组织质量与PBS体积比为1 mg∶5 μL比例混合后，用玻璃匀浆器研磨成组织匀浆，然后用离心机以3000 r/min的转速离心10 min，分离上清液，即得待测样品。然后按试剂盒说明书操作：①向标准品孔中每孔加入标准品50 μL，并做好标记。② 向待测样品每孔加入50 μL待测样品，并做好标记。③标准品孔和待测样品孔分别加入25 μL酶标志物，充分混匀。④将包被微孔板加盖后放置于37℃孵箱中孵育60 min，充分弃尽孔内液体，用预先稀释好的清洗液反复冲洗5次。以防孔内液体溢出污染其他实验孔。⑤向包括空白对照孔在内的所有孔，依次加入底物Ⅰ50 μL（HRP-avidin），再加入底物Ⅱ50 μL（TMB），室温下避光反应15 min。⑥ 反应过后每孔加入终止液（2 mol/L硫酸）50 μL，充分混匀，终止反应。⑦30 min内使用酶标仪在450 nm波长下读取吸光度值，根据标准曲线计算PGE2的浓度。PGE2和PGF2α的检测方法也按试剂盒说明书检测。

1.3.2 不同时期瘢痕组织中MMP-2蛋白的测定 采用Western bolt法。每组中取3例患者的瘢痕组织进行MMP-2蛋白含量测定，瘢痕皮肤组织按1 mg∶5 μL的比例加入含有（浓度为1 mmol/L）RIPA裂解液。冰浴条件下用玻璃匀浆器破碎组织。充分裂解后用离心机以12 000 r/min的转速离心5 min。分离上清液即为总蛋白提取液。取40 μg蛋白进行SDS-PAGE进行电泳，凝胶经半干电转仪转膜，转移好的纤维棉漂洗后，将膜置于封闭液中，防止变干，室温下于脱色摇床上摇动封闭1 h。与一抗（1∶500稀释）4℃温育过夜，充分漂洗后，加HRP标记的二抗（1∶500稀释），在室温下温育1 h，洗膜4次。最后用ECL发光试剂盒检测，在X线胶片上曝光，显影，定影。蛋白表达量是MMP-2蛋白的灰密度值与β-actin蛋白的灰密度值的比值表示。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。作图采用Graphpad prism 6.01软件。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组PGD2，PGE2和PGF2α含量的检测结果

ELISA结果显示，正常组皮肤组织中PGE2、PGD2和PGF2α的含量最低，其他六组的PGE2、PGD2和PGF2α的含量都显著性升高，差异均有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。而从瘢痕1个月组开始，三者的含量均开始降低，且在瘢痕24个月组降到最低。见表1。

2.2 各组MMP-2的含量

正常组中MMP-2的表达水平最低，烧伤早期组MMP-2的表达显著升高（P < 0.05），且从此组开始表达水平增加，在瘢痕3个月组MMP-2蛋白表达水平达到最高（P < 0.01）；瘢痕12个月组又开始降低，在瘢痕24个月组MMP-2蛋白表达水平恢复到与正常组接近的水平（P > 0.05）。见图1～2。

3 讨论

烧伤早期和瘢痕形成后的PGs含量明显高于正常皮肤。PGs作为重要的内源性炎症介质在炎症的发生发展中起着重大作用。组织损伤后，伤口渗液中会很快出现大量的PGs，并且持续一段时间。研究表明，PGs介导的创伤性炎症所引起的炎症细胞浸润和一些促纤维化细胞因子的产生可促进瘢痕组织的形成，并且PGs含量的紊乱可能是瘢痕瘙痒的一个诱发因素[5]。而烧伤早期皮肤处于重度炎症期。所以烧伤早期PGs的含量最高。PGE2是花生四烯酸经环氧化酶-2催化转化而来，花生四烯酸能够被催化首先生成不稳定的PGG2和PGH2，但是这些物质很快经过催化，最终在合成酶及异构酶的作用下，转变为稳定存在的PGD2、PGE2及PGF2[10]。所以尽管3种PGs的含量不相同，但是整个含量的变化趋势是大致相同的。

PGE2能够使组织动脉扩张，能诱导组胺水平增高，增加血管通透性，参与炎症的疼痛及发热过程[11]。此外，PGE2还能联合趋化因子发挥协同作用，激活并促使中性粒细胞向内皮细胞黏附，促进炎症细胞中活性氧和溶酶体酶的释放[12]。所以在烧伤早期，PGs的含量很高。而在瘢痕形成早期的1个月、3个月，PGs的含量相比烧伤早期要低，因为此时炎症已经好转。但组织内的PGs仍然处于较高水平。汪涌等[13]发现PGE2显著抑制正常皮肤和瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原合成，他们的实验经Dot blot杂交，发现PGE2可显著抑制瘢痕成纤维细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达，在基因转录水平抑制其胶原的合成。所以在瘢痕早期的1个月、3个月PGs含量仍然较高，可能是因为此时PGs在抑制瘢痕形成。瘢痕形成后的6个月后，PGs含量开始降低，但直至瘢痕期2年后，组织内的PGs仍然要高于正常皮肤中的PGs。这也说明PGs在瘢痕过程中有一定的作用，值得继续探究。

有研究表明，MMP-2在创伤后的第一时间均可被检测到，可作为瘢痕过度增生的急性烧伤患者血清中的标志物[14]。而本实验的结果也验证了这个结论。从烧伤早期开始，MMP-2的含量开始升高。且一直呈上升趋势，到瘢痕3个月表达达到最大水平。也验证了之前报道的MMP-2活性在人瘢痕组织显著增加这个结论[15]。MMP-2在正常皮肤中低表达，参与维持皮肤组织及其附件的正常结构、细胞外基质的代谢和新血管的形成。在增殖期的瘢痕组织中，MMP-2基因表达显著升高，如瘢痕3个月、6个月，这段时期的MMP-2都很高，与瘢痕处于增生初期，组织细胞内炎症介质、细胞因子和趋化因子等大量积累，促进细胞增殖的同时诱导MMP-2基因和蛋白表达有关[16]。所以在瘢痕增生期，MMP-2蛋白表达量达到最大。而瘢痕12个月开始呈下降，可能是因为随着伤口愈合好转，瘢痕内的细胞因子和炎症介质减少，修复细胞增殖活性降低，凋亡增加，瘢痕组成细胞的增殖和凋亡、细胞外基质的合成与降解达到相对稳定状态，此时的瘢痕就转变为成熟的增生性瘢痕[17-18]。可见MMP-2在瘢痕增殖过程中有重要的作用。

通过对PGs和MMP-2含量的变化对比研究发现，烧伤早期，当PGs含量大量增加时，MMP-2的含量开始增加，并且一直呈上升趋势。到增生晚期，瘢痕1年以后，当PGs含量逐步降低时，MMP-2的表达也逐渐减少。因为炎症因子会激发诱导MMPs的表达。所以PGs有可能通过某些通路影响到MMP-2的合成、释放，值得进一步研究，以便加深对PGs和MMP-2两者的关系的理解，以及它们在增生性瘢痕中的作用及影响。

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（收稿日期：2014-08-23 本文编辑：苏 畅）

通过对PGs和MMP-2含量的变化对比研究发现，烧伤早期，当PGs含量大量增加时，MMP-2的含量开始增加，并且一直呈上升趋势。到增生晚期，瘢痕1年以后，当PGs含量逐步降低时，MMP-2的表达也逐渐减少。因为炎症因子会激发诱导MMPs的表达。所以PGs有可能通过某些通路影响到MMP-2的合成、释放，值得进一步研究，以便加深对PGs和MMP-2两者的关系的理解，以及它们在增生性瘢痕中的作用及影响。

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（收稿日期：2014-08-23 本文编辑：苏 畅）

通过对PGs和MMP-2含量的变化对比研究发现，烧伤早期，当PGs含量大量增加时，MMP-2的含量开始增加，并且一直呈上升趋势。到增生晚期，瘢痕1年以后，当PGs含量逐步降低时，MMP-2的表达也逐渐减少。因为炎症因子会激发诱导MMPs的表达。所以PGs有可能通过某些通路影响到MMP-2的合成、释放，值得进一步研究，以便加深对PGs和MMP-2两者的关系的理解，以及它们在增生性瘢痕中的作用及影响。

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（收稿日期：2014-08-23 本文编辑：苏 畅）