褪黑素通过抑制ROS改善胰岛素抵抗HepG2细胞糖代谢

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·基础医学·

褪黑素通过抑制ROS改善胰岛素抵抗HepG2细胞糖代谢

佘美华，蒋文艳，张瑶，杨娟，尹卫东
(南华大学药学与生物科学学院生物技术系，湖南 衡阳 421001)

目的探讨褪黑素(MLT)对胰岛素抵抗(IR)HepG2细胞葡萄糖代谢的影响及机制。方法培养HepG2细胞，高糖高胰岛素(25 mmol/L葡萄糖、1 μmol/L胰岛素)诱导24h，建立IR细胞模型并给予MLT(1 nmol/L,10 nmol/L)处理。葡萄糖氧化酶法、蒽酮法和荧光探针法检测HepG2细胞的糖摄取、糖原含量及活性氧(ROS)产率。结果HGI孵育HepG2细胞24 h后，细胞的葡萄糖摄取及糖原含量明显减少(P<0.01)，ROS产率显著增加(P<0.01)；而MLT处理增加了IR细胞葡糖糖的摄取(P<0.01)和糖原合成(P<0.05)，降低ROS的水平(P<0.01)。结论MLT可能通过抑制ROS的生成而改善氧化应激，从而促进胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖的摄取和利用、增强其胰岛素敏感性。

褪黑素； 胰岛素抵抗； 葡萄糖摄取； 糖原； ROS

褪黑素(melatonin,MLT)是大脑松果体腺合成和分泌的一种吲哚类神经内分泌激素，具有调节昼夜节律的作用。近年来研究表明褪黑素参与维持机体葡萄糖稳态和改善胰岛素敏感性[1]。如实施松果体切除术后的大鼠葡萄糖耐受不良、胰岛素敏感性下降，而外源性补充MLT则能逆转这一状态[2]。Agil等[3]发现MLT能降低T2DM模型大鼠的高胰岛素血症和HOMA-IR。由于胰岛素抵抗(IR)的发生与氧化应激密切相关，氧化应激状态下ROS生成过多或清除不足，诱发细胞膜脂质过氧化，并且它还能通过多条应激敏感性信号通路影响基因表达和损伤细胞[4]，最终影响细胞的正常代谢。基于MLT、氧化应激以及胰岛素抵抗之间的联系，本实验将探讨MLT是否通过改善氧化应激来改善胰岛素抵抗。

1 材料与方法

1.1 材料来源

HepG2细胞购于北京协和细胞资源中心；MLT由以色列Neurim Pharmaceuticals公司提供，DMSO溶解后用DMEM稀释至工作浓度(DMSO终浓度低于0.01%)；胰岛素(INS)、胎牛血清(FBS)均购于Sigma公司。

1.2 细胞培养与分组处理

HepG2细胞于37°C、5% CO2饱和湿度条件下，10% FBS的L-DMEM中培养，观察细胞生长情况，细胞融合后进行传代，转入6孔板，待贴壁生长后，分正常对照组，其余为胰岛素抵抗模型组。正常对照组(IS组)以含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液培养；模型组则以含高糖高胰岛素(25 mmol/L葡萄糖和1 μmol/L胰岛素)的DMEM培养液培养24 h，再用含或不含MLT(1 nmol/L、10 nmol/L)的DMEM培养液继续培养6 h。

1.3 葡萄糖消耗实验

按照GOD-POD试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司)，将上述各组细胞分别给予有无100 nmol/L胰岛素刺激6 h后，用葡萄糖氧化酶法检测培养液中的葡萄糖含量，以未接种细胞空白复孔的糖含量均值相减，算出各孔细胞的葡萄糖摄入量。

1.4 细胞内糖原含量检测

按照糖原含量检测试剂盒(南京建成)，采用葸酮法检测上述细胞中的糖原含量。按说明将细胞消化下来，离心沉淀并加入300 μL碱液，双蒸水定容至500 μL，加显色液，沸水浴5 min，冷却后在620 nm波长下比色测定。

1.5 细胞内ROS含量检测

按照活性氧检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)，采用DCFH-DA荧光探针法检测各组细胞内ROS的含量。先去除培养液，无血清DMEM洗涤，加入DCFH-DA工作液并孵育20 min；去除工作液，用预热PBS洗3次；常规消化收集细胞，PBS洗涤3次，反复吹打成单细胞悬液，用荧光分光光度计(488 nm激发波长，525 nm发射波长)检测荧光强度。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 MLT改善高糖高胰岛素诱导HepG2细胞胰岛素抵抗

基础状态下，各组细胞的葡萄糖摄入无明显差异。在胰岛素存在条件下，IS组细胞对葡萄糖摄入量明显增加，为基础状态下的1.78倍(P<0.01)；高糖高胰岛素处理后HepG2细胞(单纯IR细胞组)，其胰岛素介导的葡萄糖摄入量显著低于IS组，下降29%(P<0.01)，说明高糖高胰岛素诱导发生胰岛素抵抗；而对胰岛素抵抗细胞进行MLT处理后，其胰岛素介导的葡萄糖摄入明显增加(P<0.01)。

图1 MLT对HepG2细胞胰岛素抵抗模型糖消耗的影响1：IS；2：IR；3：1 nmol/L MLT；4：10 nmol/L MLT. 与基础状态葡萄糖摄入相比，*：P<0.01；胰岛素介导的葡萄糖摄入，与IS组相比，#：P<0.01；与IR组相比，&：P<0.01，n=3

2.2 MLT对HepG2细胞胰岛素抵抗模型糖原含量的影响

与正常对照HepG2细胞相比，高糖高胰岛素诱导IR组细胞糖原含量减少约85%(P<0.01)；而对该IR模型细胞进行MLT处理，其糖原含量增加3倍以上(P<0.05)(图2)，提示MLT促进了高糖高胰岛素诱导细胞的糖原的合成。

2.3 MLT对胰岛素抵抗HepG2细胞ROS含量的干预作用

与正常对照HepG2细胞相比，高糖高胰岛素诱导的IR组细胞ROS增加明显，增加0.42倍(P<0.01)，MLT(1 nmol/L,10 nmol/L)处理后的IR模型细胞ROS无显著性差异。与IR组比较，低高浓度MLT处理组细胞ROS则显著减少，分别减少约27%和31%(P<0.01)。低高浓度MLT处理组相比，无显著性差异(图3)。

图2 MLT对HepG2细胞胰岛素抵抗模型糖原的影响1：IS；2：IR；3：1 nmol/L MLT；4：10 nmol/L MLT 与IS组相比，**：P<0.01，*：P<0.05；与IR组相比，#：P<0.05，n=3

图3 MLT对HepG2细胞胰岛素抵抗模型ROS的影响1：IS；2：IR；3：1 nmol/L MLT；4：10 nmol/L MLT 与IS组相比，*：P<0.01；与IR组相比，#：P<0.01，n=3

3 讨 论

肝脏是胰岛素发挥作用的主要靶器官之一，肝细胞糖代谢的紊乱对胰岛素抵抗的发生具有十分重要意义。胰岛素抵抗时，糖代谢紊乱，糖摄取能力减弱和肝糖原合成减少，导致血糖升高。本研究通过高糖高胰岛素成功诱导HepG2细胞发生IR，表现为对葡萄糖摄取减少，同时细胞内糖原合成降低，提示高糖高胰岛素抑制了细胞对葡萄糖的利用能力。

最近研究表明，反应活性氧与胰岛素抵抗的发生发展密切相关[5-7]。ROS是一类具有强氧化性的含氧物质的总称，主要包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH·)、过氧化氢(H2O2)和脂质过氧基(ROO·)等，它不仅可以直接氧化体内生物活性大分子如蛋白质、脂质及核酸等而使细胞受损，而且能够行使第二信使信号分子功能激活各种应激激酶，活化多条氧化应激敏感性信号通路，干扰细胞胰岛素信号转导，导致胰岛素抵抗。在活性氧介导的氧化应激状态下，3T3-L1脂肪细胞胰岛素受体底物(IRS-1)和(IRS-2)丝氨酸残基磷酸化，进而下调IRS-1的表达，导致胰岛素抵抗[6]。Evans等[7]发现高糖所致的ROS是通过激活AGES、NF-κB及PKC等途径导致胰岛素抵抗的。Houstis等[8]用地塞米松和TNF-α处理细胞，发现细胞内ROS产生增加，而应用抗氧化药物降低ROS水平后IR得到改善。可见清除活性氧的含量，有助于改善胰岛素抵抗。本研究发现高糖高胰岛素培养显著增加了HepG2细胞ROS含量，推测ROS是高糖高胰岛素诱导发生胰岛素抵抗的重要因素。

褪黑素是大脑松果体腺合成分泌的一种吲哚类神经内分泌激素，除具有改善睡眠，改善免疫功能以外，还具有强效的抗氧化性，它可以直接清除自由基、减少自由基的生成，提高抗氧化酶的活性等。

本研究发现褪黑素显著增加了其胰岛素刺激的葡萄糖摄入和糖原的合成，同时ROS减少了含量。提示MLT通过降低ROS水平改善氧化应激状态，从而促进了高糖高胰岛素培育HepG2细胞对葡萄糖的利用率，改善胰岛素抵抗。

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[3] Agil A,Rosado I,Ruiz R,et al.Melatonin improves glucose homeostasis in young Zucker diabetic fatty rats[J].Pineal Res,2012,52(2):203-210.

[4] Bolisetty S,Jaimes EA.Mitochondria and reactive oxygen species:physiology and pathophysiology[J].Int J Mol Sci,2013,14(3):6306-6344.

[5] Guan L,Feng H,Gong D,et al.Genipin ameliorates age-related insulin resistance through inhibiting hepatic oxidative stress and mitochondrial dysfunction[J].Exp Gerontol,2013,48(12):1387-1394.

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[7] Evans JL,Goldfine ID,Maddux BA,et al.Are oxidative stress-activated signaling pathways mediators of insulin resistance and beta-cell dysfunction[J]？Diabetes,2003,52(1):1-8.

[8] Houstis N,Rosen ED,Lander ES.Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance[J].Nature,2006,440(7086):944-948.

MelatoninAmelioratesGlucoseMetabolismviaInhibitingROSGenerationinInsulinResistantHepG2CellsInducedbyHighGlucoseandInsulin

SHE Meihua,JIANG Wenyan,ZHANG Yao,et al
(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,SchoolofPharmaceuticalandBiologicalScience,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the effects of melatonin on glucose metabolism in high glucose and insulin-induced insulin resistant HepG2 cells.MethodsInsulin resistant HepG2 cells were induced by high glucose and insulin (HGI,25 mmol/L and 1 μmol/L respectively) coculture for 24 h,and then melatonin was added.The uptake of glucose was measured by glucose oxidase method,anthrone method was used to detect the Glycogen synthesis and fluorescence probe was used to detect ROS production.ResultsHGI incubating led to significant decreases in insulin-stimulated glucose uptake and glycogen synthesis in HepG2 cells (P<0.01),but ROS production increased (P<0.01).However,MLT treatment reversed the above state by increasing glucose uptake (P<0.01) and glycogen synthesis (P<0.05),inhibiting the generation of ROS(P<0.01).ConclusionsMLT could improve oxidative stress by inhibiting the production of ROS,and thereby increase glucose utilization and improve insulin sensitivity of insulin resistance HepG2 cells.

MLT; insulin resistance; glucose uptake; glycogen; ROS

2095-1116(2014)05-0433-03

2014-03-06

国家自然科学基金(81200590)；高等学校博士学科点专项科研基金(20124324120005).

佘美华，博士，副教授，研究方向：糖尿病的分子机制研究，E-mail：shemhbb@163.com，通信作者尹卫东，教授，博士生导师，研究方向：糖尿病的分子机制研究，E-mail：wdy20042004@126.com.

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(此文编辑：秦旭平)