纺锤体检查点蛋白Cenp-E在肝癌组织的表达及临床意义

， ，卓然， ， (南华大学附属第二医院检验科，湖南 衡阳 421001)

·临床医学·

纺锤体检查点蛋白Cenp-E在肝癌组织的表达及临床意义

刘斌，刘婧，刘卓然，汪翼，吴广
(南华大学附属第二医院检验科，湖南 衡阳 421001)

目的观察纺锤体检查点蛋白(Cenp-E)在肝癌组织和人类正常肝组织表达水平的差异，以探讨Cenp-E蛋白在肝癌细胞中的表达及临床意义。方法用荧光定量PCR和Western blot分别检测Cenp-E基因和蛋白在肝癌组织和正常肝组织的表达水平。结果正常肝组织中Cenp-E基因mRNA水平(0.023 78±0.009 73)明显高于肝癌组织(0.014 58±0.008 73)；Cenp-E蛋白表达量在正常肝组织中(0.656±0.012)明显高于在肝癌组织中的表达(0.301±0.009)，且二者有显著性差异。结论Cenp-E低表达在肝癌的发生过程中起重要作用。

纺锤体检查点； Cenp-E基因； 肝癌

肝细胞癌(human hepatocellular carcinoma，HCC)是十大恶性肿瘤之一,发生机制仍不十分清楚。研究证实,HCC存在基因组不稳定性或遗传学不稳定性。应用比较基因组杂交(CGH)技术对50例的HCC基因组图谱进行了分析,发现DNA缺失普遍存在于4q(70%)、8p(65%)、17p(51%)、13q(37%)、6p(37%)和1p(30%)；而DNA增缢频繁发生在8q(60%)、1q(58%)、6p(30%)和17q(30%),表明在HCC的发生发展过程中存在多种染色体的异常[1]。以上表明HCC的发生是一种多染色体，多基因异常的结果。但具体涉及哪些基因以及他们在癌变过程中所起的作用尚有待进一步研究。

纺锤体检查点(spindle checkpoint，SCP)的功能是监测细胞染色体分离。检查点功能丧失的一个后果是遗传不稳定性,促使细胞更容易恶变。由此可见由于纺锤体检查点在有丝分裂中负责监督染色体排位和分离,它们的结构改变和组分丧失也可以引发一些癌症[2]。有报道SCP另一个重要基因有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(MAD2)在乳腺癌中蛋白表达是降低的[3]。本研究探讨纺锤体检查点蛋白Cemp-E在肝癌组织的表达情况，为肝癌的临床诊断提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 实验材料

收集2012年1月～2013年10月南华大学附属第一医院和南华大学附属第二医院肝癌患者术中肝癌组织及癌旁正常肝组织21例。术前经患者及家属同意,并通过南华大学伦理委员会批准。DNA及质粒抽提试剂盒，琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自上海华舜公司。Cenp-E和GAPDH的兔一抗，羊抗兔二抗购自Santa-Cruz公司。SYBR Green染料荧光定量试剂购自Takara公司。RIPA裂解液购自上海申能博彩。

1.2 标准质粒的构建

1.2.1 RNA的提取和逆转录 将肝癌组织及癌旁正常组织按照试剂盒说明书操作用Trizol试剂(GIBICO公司)提取总RNA。然后按照Takara公司逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA保存备用。

1.2.2 PCR反应及产物鉴定 引物序列由Takara公司设计并合成,Cenp-E基因上游引物：5′-GCTGTCTGCGATACTGTGAAC-3′；下游引物：5′-CAATCCCTCCAAAATCAAGTG-3′。内参GAPDH上游引物：5′-GCAGAGGGGGCAGAGATGA-3′，下游引物：5′-ACTCCTCTGGCTTCTCTGGTT-3′。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 15 s，63 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，35个循环；最后72 ℃退火延伸10 min；PCR产物4 ℃保存。

1.2.3 T-A克隆 将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,按照华舜胶回收试剂盒说明书纯化PCR产物,按照Takara操作说明书将其连接到pMD18-T质粒上，转入DH5a感受态细菌中，铺板挑阳性菌落做菌落PCR，初步鉴定为阳性者增菌提质粒送公司测序，经DNAssist Versuib 1.02软件比对后制备纯化质粒用于定量PCR标准曲线的建立。

1.3 荧光定量PCR

用SYBR Green染料荧光定量法(Takara公司的试剂)检测Cenp-E基因的mRNA的水平，Cenp-E基因与内参引物见前。用已稀释的标准质粒作为阳性标准品。扩增条件为：95 ℃ 10 s 1个循环 ；95 ℃ 5 s，63 ℃ 31 s 40个循环。

1.4 Western blot免疫印迹

1.4.1 蛋白质抽提和定量(参照试剂说明)，步骤如下 (1)每100 mg组织加入400 μL RIPA裂解液和4 μL PMSF。放入匀浆器中于冰上研磨。

(2)移至1.5 mL Ep管，冰上放置30 min后，4 ℃ 13 000 rpm离心30 min。

(3)收集上清即为蛋白液，分装为50 μL每管于-20 ℃保存备用。

(4)采用BCA法进行蛋白质定量测定.

1.4.2 Western blot检测Cenp-E蛋白的表达 将肝癌组织，提出的蛋白经10%十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至PVDF膜．兔一抗的释度为1∶200；羊抗兔二抗皆作1∶5 000稀释;ECL法显色。

1.5 统计学方法

使用SPSS16.0统计软件包处理数据,结果以平均数±标准差表示。组内比较用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05差异有显著性。

2.1 Cenp-E基因mRNA水平分析

荧光定量PCR检测Cenp-E基因在各组的mRNA水平，溶解曲线如图1所示，以Cenp-E基因mRNA拷贝数/GAPDH基因mRNA拷贝数的均值作为该样品中Cenp-E基因表达水平，在正常肝组织中表达水平(0.023 78±0.009 73)高于肝癌组织(0.014 58±0.008 73),差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 肝癌组织Cenp-E蛋白表达

Cenp-E蛋白表达如图2所示，可以发现Cenp-E与GAPDH的灰度值比值在正常肝组织中为0.656±0.012,在肝癌组织中为0.301±0.009.P<0.05,差异有统计学意义(n=21)。

3 讨 论

Cenp-E主要定位于着丝粒的外层,是一种重要着丝粒特异蛋白，同时也是着丝粒点与微管有效连接的动力蛋白。越来越多的实验证明Cenp-E在SCP机制起着非常重要的作用，现在研究表明，一定量的Cenp-E水平，对SCP的激活是起非常重要的作用[4]。Cenp-E主要通过BubR1来影响SCP机制，当Cenp-E与BubR1作用时，通过一系列的分子反应后，MAD2开始从着丝粒脱落，姐妹染色单体开始分离，从而导致细胞分裂开始[5]。

图2 Cenp-E蛋白表达. 1：正常肝组织；2：肝癌组织. 与正常肝组织相比，*：P<0.05

另外研究发现在许多癌细胞有异常的SCP功能。MAD2表达降低见于鼻咽癌、肝细胞癌、人乳腺癌及其一些乳腺癌细胞系和卵巢癌等，并与SCP缺陷切相关[6]。Bubl是SCP中另外一种较重要的癌基因，Bubl的mRNA降低也见于结肠癌和急性粒细胞性白血病[7]，高水平Bubl、BubR1和Bub3表达也与胃癌细胞增殖能力密切相关[8]。但Cenp-E与肿瘤之间的关系还不明确。

本研究发现Cenp-E在正常肝组织中表达明显高于肝癌组织，肝癌组织中Cenp-E蛋白表达的降低引起的纺锤体检查点监控功能下降，很可能是导致肝癌细胞有丝分裂失控并导致染色体数目紊乱的重要原因之一。我们推测肝癌组织Cenp-E表达水平的不足可能是引起纺锤体检查点的功能异常的重要原因之一，最终导致细胞分裂失控和染色体数目异常以及肿瘤细胞的发生。

由于组织标本包含细胞的复杂性和不纯性，本研究只能大致从量上分析肝癌和正常组织Cenp-E的表达差异。进一步在肝癌细胞系和正常细胞系中研究Cenp-E的功能，将为进一步探明肝癌的发生机制奠定基础，也为肝癌临床早期预防及诊断治疗提供新的依据。

[1] Taylor SS,Scott MI,Holland AJ,et al.The spindle checkpoint:a quality contro-lmechanism which ensures accurate chromosome Segregation[J].Chromosome Res,2004,12(6):599-616.

[2] Karess R.Rod-Zw10-Zwilch:a key player in the spindle checkpoint.Trends Cell Biol,2005,15(7):386-392.

[3] Maiato H.,DeLuca J,Salmon ED,et al.The dynamic kinetochore-microtubulein-terface[J].Cell Sci,2004,117(23):5461-5477.

[4] Gardner MK.CENP-E hangs on at dynamic microtubuie ends[J].Nat Cell Biol,2013 15(9):1030-1032.

[5] Shrestha RL,Draviam VM.Lateral to end-on conversion of chromosome-micro-tubule attachment require kinesins CENP-E and MCAK[J].Curr Biol,2103,23(16):1514-1526.

[6] Waters JC,Chen RH,Murray,et al.Localization of Mad2 to kinetochores depends on microtubule attachment,not tension[J].Cell Biol,1998,141(5):1181-1191.

[7] Peters JM.The anaphase-promoting complex:proteolysis in mitosis and beyond[J].Mol Cell,2002,9(5):931-943.

[8] Kim Y,Holland AJ,Lan W,et al.Aurora kinase and protein phosphatase 1 Mediate chromosome congression through regulation of CENP-E[J].Cell,2010,142(3) 444-445.

ExpressionoftheSpindleCheckpointProteinCenp-EintheHumanHepatomTissueandItsClinicalSignificance

LIU Bin,LIU Jing,LIU Zhuoran,et al
(Clinicallaboratory,thesecondaffiliatedhospital,universityofsouthchina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo study the differential expression and its clinical significance of the spindle checkpoint protein Cenp-E gene between the human hepatoma and hepatic tissue.MethodsReal-time fluorescent-quantitation PCR and Western blot were employed to detect the expressions of the Cenp-E mRNA and protein,respectively.ResultsThe expression of the Cenp-E mRNA in human hepatic tissue(0.023 78±0.009 73) was higher than that in human hepatoma tissue(0.014 58±0.008 73).The expression of the Cenp-E protein in human hepatic tissue(0.656±0.012) was higher than that in human hepatoma tissue(0.301±0.009).ConclusionCenp-E gene low expression in human hepatocellular carcinoma plays an important role in the its developmental process.

spindle checkpoint; Cenp-E gene; hepatoma

2095-1116(2014)05-0459-03

2014-01-17

湖南省教育厅课题(No.13C796).

刘斌 ,硕士，主管技师，研究方向：肿瘤细胞周期和染色体分裂机制，E-mail: 29869248@.qq.com.

446

A

(此文编辑：秦旭平)