重组人ADAM15去整合素区域蛋白抑制HeLa细胞的增殖及迁移

侯 颖， 储 敏， 蔡燕飞， 杜芳芳， 王晓敏， 陈 蕴， 金 坚

（江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

整合素金属蛋白酶家族蛋白 （a disintegrin and metalloproteinase，ADAM）， 也 被 称 为 MDC（Metalloproteinase/Disintegrin/Cysteine-rich），是一类锚定于细胞膜表面的跨膜蛋白家族[1]，自1990年发现第一个家族成员以来[2]，迄今为止共有23种ADAM家族蛋白在人类基因中被发现。ADAM家族蛋白参与蛋白水解、生长因子和细胞因子的释放、细胞外基质降解、细胞的融合、迁移、粘附及信号转导等生物功能[3]。在病理学中，ADAM家族蛋白亦参与了炎症和肿瘤的发生和发展。ADAM家族蛋白中，ADAM15被发现与多种肿瘤的发生和发展密切相关，在多种实体瘤发生时，如胃癌、肝癌、前列腺癌等，ADAM15的表达都会上调[4-5]。另外，由于ADAM15的去整合素区域含有整合素结合位点RGD（arginine-glycine-asparti，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）序列，具有典型的药物分子靶点结构特征，因此有希望作为临床肿瘤诊断的标志物及药物设计的靶点。

人ADAM15去整合素区域蛋白由91个氨基酸残基构成，相对分子质量为9 805，作者所在实验室成功利用大肠杆菌表达系统表达并分离纯化出重组人ADAM15去整合素区域蛋白，记为rhddADAM15（recombinant human disintegrin domain of ADAM15）[6]。作者以人宫颈癌细胞HeLa为模型，检测了rhddADAM15对HeLa增殖及迁移的影响，并初步确定了rhddADAM15作用机理及其相关的信号通路，为进一步研究其对肿瘤的作用机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

rhddADAM15：由作者所在实验室制备；人宫颈癌细胞HeLa：购自上海中科院细胞库；培养细胞所用RPMI-1640基础培养基、小牛血清、青霉素、链霉素：购自Gibco公司；胰蛋白酶：购自碧云天公司；脂质体Lipo2000：购于Invitrogen公司；细胞实验用各种孔板：购自Corning公司；SRB：购自Sigma公司；表皮生长因子（EGF）及 U0125：购自 Cell signaling公司；CM-Dil：购自 Invitrogen公司；兔源抗rhddADAM15的一抗：由作者所在实验室制作保存；辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗：购自碧云天公司；细胞周期试剂盒：购自南京凯基生物。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 细胞采用含10%小牛血清的1640培养基，添加1×105U/L的青霉素和100 mg/L链霉素，置于37℃5%CO2培养箱培养。当细胞生长至所需要密度时用胰蛋白酶消化处理，收集细胞，计数并根据需要重悬成所需浓度。

1.2.2 SRB法测细胞增殖 将细胞消化后计数，用含10%小牛血清的培养基稀释至 （0.6～0.8）×108个/L，每孔100 μL铺于96孔板，培养24 h后，吸除培养基，将含有不同浓度的rhddADAM15、丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinases，MAPKs）通路的激动剂表皮生长因子（EGF）及MAPK通路中细胞外调节蛋白激酶 （extracellular regulated protein kinases，ERK）抑制剂U0125的细胞培养液分别加入至96孔板。各个药物的各个浓度设置至少3个副孔，同时设置不加任何药物的孔为阴性对照及不铺细胞只加培养液的孔为空白对照孔。继续培养24 h后，弃去各孔培养基，加入100 μL的10%TCA溶液固定40 min后，弃去TCA溶液，超纯水洗板2次，在空气中干燥后每孔加入100 μL的0.4%SRB溶液，于37℃孵育30 min，弃去SRB溶液，用1%醋酸溶液清洗至无色后甩干，每孔加入100 μL 的 10 mmol/L Tris溶液，10 min 后利用酶标仪在570 nm处检测其吸光值。

1.2.3 划痕法测细胞迁移 将细胞消化后计数，用10%牛血清的培养基稀释至 （0.6～0.8）×108个/L，每孔100 μL，均匀铺于96孔板。待细胞生长至铺满孔底80%～90%时，用枪头在孔底均匀笔直的划出约1 mm细痕，PBS轻轻洗2～3次，洗去划掉的细胞，加入含有不同浓度的rhddADAM15的细胞培养液，在0、24 h时分别定点拍照，观察并记录细胞迁移情况。 迁移计算公式为式（2）、（3）：

1.2.4 PI单染法测细胞周期 处于对数期的待检测细胞消化后铺于 6 孔板，每孔（3～4）×105个，生长24 h 后 加 入 终 浓 度 分 别 为 0、1.5、4 μmol/L 的rhddADAM15继续培养24 h，弃去上清液，PBS洗涤、胰蛋白酶消化后收集细胞，再用PBS洗涤两遍后，70%的冷乙醇固定2 h至过夜，洗去固定液，经PBS清洗后收集细胞，加入50 μg/mL的RNAase，于37℃孵育30 min后，加入PI置于4℃避光染色，0.5 h后上机检测。数据利用Modfit软件进行分析。

1.2.5 人ADAM15去整合素区域在HeLa细胞内的表达质粒构建 以作者所在实验室保存的质粒pGEX-4T-1/ddADAM15作为模板，利用以下引物克隆人 ADAM15去整合素区域：上游引物，5’-CCGCTCGAGCGGGCCACCATGGCTGCTTTCTGC-3’， 下游引物 5’-TAAAGCGGCCGCAAATTTACTC GCCATCCCCT-3’。将PCR产物纯化后，利用XhoI及NotI酶切，连于pCI-neo载体。构建好的pCI-neo/ddADAM15质粒经测序验证正确后，利用Lipo2000转入HeLa细胞内，转染后的细胞株记做HeLa/AD。转染4、6 h后，收集细胞并裂解收取蛋白质，利用抗rhddADAM15的一抗进行Western blot实验，分析细胞内人ADAM15去整合素区域蛋白质的表达水平。

1.2.6 斑马鱼体内的肿瘤细胞移植模型 本实验与杭州环特生物技术有限公司合作开展，所用斑马鱼为野生型斑马鱼，由环特生物技术有限公司培养提供。本实验用鱼为斑马鱼幼鱼。斑马鱼的繁殖以自然成对交配的方式进行。阳性对照为巴马司他，阴性对照为PBS溶液。

1）肿瘤细胞移植：HeLa生长至聚合度为90%以上后，弃去培养液，用 PBS洗涤2～3遍，加入 1 mL质量浓度为5 μg/mL荧光素CM-Dil溶液，将培养瓶置于4℃冰箱。15 min后弃去CM-Dil溶液，用PBS洗涤2～3遍，消化收集标记好的细胞，置于冰上待用。将受精48 h的斑马鱼置于0.4%三卡因甲磺酸进行麻醉后，利用显微注射仪将约800个标记好的HeLa细胞注入斑马鱼卵黄囊，以此作为肿瘤细胞在斑马鱼体内的移植模型。

2）rhddADAM15给药：HeLa细胞移植到斑马鱼体内24 h后，在荧光显微镜下挑选肿瘤细胞生长良好，即荧光强度较亮的斑马鱼，将不同量的rhddADAM15，PBS（阴性对照）及巴马司他（阳性对照，450 ng/鱼）显微注射到斑马鱼体内，每组至少10条。继续饲养48 h后，将斑马鱼麻醉固定后拍照，利用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析。荧光强度（S）表示细胞的增殖程度，面积（A）表示细胞的迁移程度。rhddADAM15对斑马鱼体内肿瘤细胞的增殖抑制率及迁移抑制率计算公式为式（4）～（5）。

2 结果与讨论

2.1 rhddADAM15抑制HeLa细胞增殖及迁移

SRB检测法显示rhddADAM15对HeLa细胞增殖有明显抑制，抑制率随着rhddADAM15浓度的升高而增大，在0～8 μmol/L内呈剂量依赖性，见图1。数据分析得，rhddADAM15抑制HeLa细胞增殖的IC50为2.44 μmol/L。利用划痕法显示rhddADAM15对HeLa细胞的迁移能力也有明显抑制，且呈剂量依赖性，计算得rhddADAM15抑制HeLa细胞迁移的 IC50为 1.60 μmol/L。

图1 rhddADAM15抑制HeLa细胞增殖及迁移Fig.1 rhddADAM15 inhibited the proliferation and migration of HeLa cells

2.2 ADAM15去整合素区域蛋白过表达抑制HeLa细胞的迁移及细胞周期

转染4、6 h后，利用Western blot分析HeLa/AD细胞内ADAM15去整合素区域蛋白质的表达水平，结果见图2。转染4 h后，ADAM15去整合素区域蛋白已有表达，6 h后表达水平较高。因此我们选择转染后6 h作为检测时间点，检测HeLa细胞周期及迁移能力的变化。

如表1所示，与正常HeLa细胞相比，HeLa/AD的迁移抑制率为 18.27%±2.15%， 而 4 μmol/L rhddADAM15作用于HeLa细胞后，HeLa细胞的迁移抑制率为96.37%±2.35%，抑制率远远大于HeLa/AD；rhddADAM15处理后，HeLa细胞的S期含量上升约4%，G2/M期含量下降约3.1%，G0/G1期下降约1%；与rhddADAM15处理后的HeLa细胞相似，和野生型HeLa细胞相比，HeLa/AD细胞也具有S期的部分阻滞，阻滞率约为5%，G2/M期含量下降约3%。转染空质粒的对照组S期含量下降，G2/M期略微升高，证明转染试剂对细胞周期也有一定影响。

图2 ADAM15去整合素区域蛋白在HeLa细胞内的表达Fig.2 Expression of the disintegrin domain of ADAM15 in HeLa cells

表1 HeLa/AD及HeLa细胞经过rhddADAM15处理后的细胞周期及迁移能力变化Table 1 Cell cycle arrest and migration inhibition of Hela/AD or HeLa cells treated with rhddADAM15

2.3 相关通路抑制剂及激动剂对HeLa细胞的增殖影响

rhddADAM15抑制HeLa细胞的增殖，阻滞其细胞周期，为了研究rhddADAM15抑制HeLa细胞增殖作用相关的通路，考察了MAPK通路激动剂EGF及ERK1/2通路抑制剂U0125对rhddADAM15处理后HeLa细胞增殖的影响。实验中所用rhddADAM15的浓度为1.0 μmol/L，EGF浓度为0.8 nmol/L，U0125浓度为 10 nmol/L， 结果见图 3。rhddADAM15可抑制HeLa细胞的增殖（柱1），EGF可促进HeLa细胞的增殖并可逆转rhddADAM15引起的细胞增殖抑制 （柱2，3），在EGF的作用下，rhddADAM15对HeLa细胞增殖并没有抑制效果，只是减弱EGF对HeLa细胞增殖的促进作用 （柱3）；U0125同样也能抑制HeLa细胞的增殖 （柱4），rhddADAM15与U0125联用会使HeLa的增殖抑制增强 （柱 5）；EGF可以逆转 U0125及 U0125与rhddADAM15联用引起的增殖抑制作用 （柱6、7），即 EGF存在下，U0125及 U0125与 rhddADAM15联用并不能引起HeLa细胞的增殖抑制，HeLa细胞仍会有一定程度的增殖促进。

图3 rhddADAM15，EGF，及U0125对HeLa细胞增殖的影响Fig.3 Effect of rhddADAM15，EGF，and U0125 on the proliferation of HeLa cells

2.4 rhddADAM15对斑马鱼体内HeLa细胞生长及转移的影响

图4 rhddADAM15抑制斑马鱼体内HeLa细胞的生长及转移Fig.4 Inhibitory effect of rhddADAM15 on the proliferation and metastasis of HeLa cells in zebrafish xenografts

HeLa细胞移植于斑马鱼体内后，可以正常生长，如图4A所示，移植3 d以后，HeLa细胞在斑马鱼体内增殖并转移，表现为红色荧光范围变广。经过阳性对照巴马司他及rhddADAM15处理后，斑马鱼体内HeLa细胞的荧光面积减小，亮度变暗 （图4B）。统计结果显示，rhddADAM15作用后斑马鱼体内HeLa细胞的荧光强度及荧光面积减弱呈剂量依赖性，在rhddADAM15最大非致死剂量，即7.5 pmol/鱼的剂量下，rhddADAM15对HeLa细胞在斑马鱼体内增殖的抑制率为53%±1.49%，转移抑制率为51%±2.83%；在巴马司他最大非致死剂量，即490 pmol/鱼的剂量下，巴马司他对HeLa细胞在斑马鱼体内生长的抑制率为39%±2.51%，转移抑制率为43%±2.90%。

3 结语

整合素作为存在于细胞表面的重要黏附分子，可介导细胞与细胞及细胞与基质的黏附，对细胞基因表达与调控、细胞增殖、分化与凋亡，在肿瘤的发生发展过程中起着非常重要的作用[7-8]。去整合素可以通过竞争性抑制阻断整合素与细胞外基质的相互作用，干扰由整合素介导的信号转导通路[9]。

已有的研究发现，rhddADAM15对多种肿瘤细胞的增殖均有较强的抑制作用，有较为广谱的抗癌性[4，10]。 在本研究中，rhddADAM15可以显著抑制人宫颈癌Hela细胞在体外及斑马鱼体内的增殖及转移，抑制效果呈剂量依赖性；rhddADAM15处理后，HeLa细胞S期阻滞率约4%；而通过瞬时转染使ADAM15去整合素区域蛋白在HeLa细胞内过表达，得到HeLa/AD细胞，其迁移能力较野生型HeLa细胞有微弱的下降，S期阻滞率约为5%。以上实验证明，rhddADAM15作为外源蛋白及细胞内表达的内源蛋白，均可抑制细胞的迁移及诱导S期阻滞，虽然抑制及诱导强度不同，仍可说明rhddADAM15在细胞内及细胞表面均有其作用靶点。

rhddADAM15发挥功能的一个重要活性位点为其可与整合素相互作用的RGD序列[4]。细胞的生存与增殖，都需要与细胞外基质的相互作用，整合素是细胞表面受体的主要家族，对细胞和细胞外基质的粘附起介导作用。整合素参与了一系列的信号通路，调节细胞质蛋白激酶，生长因子受体和离子通道的活性，调控细胞内的肌动蛋白细胞骨架的组织。整合素还可以调节细胞周期，控制细胞存活、增殖、退出细胞周期或者细胞分化[8]。Chong等发现，ADAM15激活Src/Erk途径，来调整内皮细胞的通透性及中性粒细胞的迁移[11]。MAPK信号通路在调节细胞增殖、分化、凋亡以及迁移方面发挥重要作用，并与炎症、肿瘤等多种疾病的发生密切相关[12]。本研究表明，EGF可以逆转rhddADAM15及rhddADAM15与ERK抑制剂U0125引起的HeLa细胞增殖抑制，表明rhddADAM15对HeLa细胞增殖的抑制与MAPK通路密切相关。虽然对于rhddADAM15的具体作用靶点及机制仍不清楚，但是本研究为进一步探究rhddADAM15参与的激酶级联激活过程提供了研究方向，为rhddADAM15的成药性提供了研究基础。

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