RP-HPLC法测定消痛灵中延胡索乙素含量的方法研究

汪军 姚闽

（江西省药物研究所 南昌330029）

消痛灵是由制川乌、延胡索、胡椒等中药组成的传统复方制剂。其中延胡索辛甘温，入肺、肝、脾三经，活血散瘀、理气止痛，治一身上下诸痛。主治胃痛、胸腹痛、疝痛、痛经、月经不调、产后瘀血、跌打损伤[1]。其主要成分为生物碱类，其中属叔胺类者含量约0.65%，属季铵类者约0.3%。叔胺类生物碱延胡索乙素为主要有效成分。本实验的目的是采用HPLC法测定方中延胡索乙素的含量，进而达到控制消痛灵的质量。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料 Agilent1200高效液相色谱仪；U-3000型紫外-可见分光光度计（日本日立公司）；AE-240电子分析天平；PHS-3S精密pH计；KQ-250VDB型超声机。色谱甲醇、双蒸水、乙醚、磷酸、异丙醇、三乙胺均为分析纯。消痛灵（自制）、延胡索乙素购自中国药品生物制品检定所（批号：110726-200409）

1.2 方法 李红艳等采用Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液（pH 7.65，65:35）[2]；陆益等用乙醚提取香术止痛酊中延胡索乙素，使用Zorbax ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇 -水（67:33）为流动相[3]；陈再兴等采用Kromail C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈 -0.1%磷酸溶液（pH 6.5）为流动相[4]，检测波长均为280 nm，结果表明方法可行。综合文献资料，本实验拟采用色谱条件为：色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，5μm）（大连依利特）；流动相：甲醇-0.01%磷酸溶液（三乙胺调pH=6.0，34:66）；柱温：25℃；检测波长：280 nm；流速：1.00 mL/min。

1.2.1 对照品溶液的制备 精密称取延胡索乙素对照品适量加甲醇制成每1 mL含对照品40 μg的溶液，摇匀即得。

1.2.2 供试品溶液的制备 精密称取消痛灵2.0 g置锥形瓶中，加适量20%乙醇超声溶解，用0.1 mol/mL HCl调至酸性，用乙醚振摇萃取3次，每次30 mL，弃去乙醚层，剩余液体用氨试液调至碱性，再用乙醚萃取3次，用量分别为40 mL、30 mL、20 mL，合并乙醚液至水浴锅上蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，摇匀，微孔滤膜滤过，即得。阴性样品制备方法同上。

2 结果

精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，测定。研究结果表明，延胡索乙素保留时间为22 min左右，理论塔板数以延胡索乙素峰计为5 249，且其能够与样品中的其它物质很好地分离，阴性样品无干扰。

2.1 线性关系的考察 配制浓度分别为0.001 5 mg/mL、0.003 0 mg/mL、0.004 5 mg/mL、0.006 0 mg/mL、0.007 5 mg/mL、0.009 0 mg/mL 的对照品溶液，分别取20 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标，延胡索乙素的进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：y=9027.9x+36.747，R=0.9993，线性范围 0.0015～0.009 0mg/mL。

2.2 精密度试验 在相同色谱条件下，取同一延胡索乙素对照品溶液（0.004 5 mg/mL）20 μL，连续进样6次，平均峰面积为804.3，RSD 0.74%。

2.3 稳定性

取同一供试样品溶液，每隔1 h进样1次，共进样6次，平均峰面积为433.9，RSD 1.77%，结果表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.4 重复性试验 取同一批消痛灵6份，依上法测定，延胡索乙素平均含量0.66%，RSD 1.35%，结果表明方法重现性良好。

2.5 加样回收实验 分别精密称取已知含量的样品（共6份），每份约1.0 g，分别精密加入对照品溶液，按上述方法测定并计算回收率，结果延胡索乙素平均回收率为95.4%、RSD为1.71%。

2.6 样品处理方法的考察

2.6.1 提取溶媒对延胡索乙素提取效果的影响庄建红等采用超声、冷浸、热回流3种不同的提取方法，对延胡索中延胡索乙素含量测定进行比较，结果表明超声提取方法含量高，操作简便[5]。因此本实验精密称取等量的消痛灵分别用20%乙醇、0.1 mol/mL HCl、氨水 -甲醇（1:20）超声溶解，按供试品溶液的制备方法处理，在以上色谱条件下测定。结果显示，以氨水-甲醇（1:20）为溶媒时，延胡索乙素的色谱峰面积均未达到自动积分的最小值；以0.1 mol/mL HCl为溶媒时延胡索乙素的峰面积明显小于以20%乙醇为溶媒时的峰面积，故最终确定用20%乙醇作为提取溶媒。见表1。

表1 溶媒对延胡索乙素提取效果影响测定结果

2.6.2 萃取溶剂对延胡索乙素提取效果的影响精密称取等量的消痛灵分别用20%乙醇超声溶解，酸碱除杂后，分别用乙醚、乙酸乙酯萃取。制得的供试品溶液在以上色谱条件下测定，比较结果后发现用乙醚萃取制得的供试品溶液峰形较乙酸乙酯好，故最终确定用乙醚作为萃取溶剂。见表2。

表2 不同萃取溶剂条件下延胡索乙素峰形比较

2.6.3 色谱柱对延胡索乙素HPLC色谱峰的影响 通过对延胡索乙素的HPLC条件的考察，发现延胡索乙素在HPLC含测中使用不同的色谱柱，延胡索乙素的含量、保留时间及峰形均会受到一定的影响。见表3。

表3 不同色谱柱对消痛灵提取物延胡索乙素色谱峰的影响

3 讨论

确定一个最优的样品处理方法对研究含量测定，将其用于中药质量控制至关重要。本实验考察了提取溶媒、萃取剂、色谱柱、柱温等因素对延胡索乙素的影响，最终确定以20%乙醇-0.1 mol/L HCl-氨试液-乙醚为最佳提取系统。但是在萃取过程中产生的乳化现象对延胡索乙素的含量测定有一定的影响，通过实验发现柱温对延胡索乙素色谱峰的影响较小，虽然较高的柱温能使延胡索乙素的出峰时间缩短，但延胡索乙素与其他成分的分离改善不大。选用不同的色谱柱对延胡索乙素含量、保留时间及峰形会受到一定的影响，通过本实验结果看，选择250 nm长度的色谱柱分离效果较好，结果更准确。本实验对消痛灵中延胡索乙素的含量测定方法进行了系统地考察，并建立了科学、合理、可操作性强、专一性好的含量测定方法，该方法可较好地控制中药复方消痛灵的质量。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].第2部.北京:化学工业出版社,2005.130-131

[2]李红艳,廖锦红,陈爱青,等.反相高效液相色谱法同时测定中药延胡索中延胡索乙素和原阿片碱的含量[J].咸宁学院学报,2008,28(3):98-101

[3]陆益,黎远冬,梁宁生,等.RP-HPLC法测定香术止痛酊中延胡索乙素的含量[J].广西医学院学报,2008,25(3):427-428

[4]陈再兴,孟舒,姜鸿,等.反相高效液相色谱法同时测定不同产地夏天无药材中原阿片碱和延胡索乙素的含量 [J].天津中医药,2008,25(4):334-336

[5]庄建红,简惠,王俊香,等.延胡索中延胡索乙素含量测定提取方法的研究[J].时珍国医国药,1998,9(5):421