和厚朴酚脂质体的制备及表征

吴德强

（南昌大学第二附属医院 江西南昌330006）

和厚朴酚（honokiol）是厚朴中的主要有效成分之一，是厚朴发挥药效的重要物质基础。现代药理学研究证实，和厚朴酚除了具有抗炎、抗菌、抗氧化、拮抗钙调素、调节胃肠功能等多种药理活性[1～2]，还具有明显的抗肿瘤活性[3～5]。由于结构中含有酚羟基，所以稳定性不好，容易被氧化。尤其是其水溶性差，大大限制了和厚朴酚的制剂开发和临床应用。脂质体作为一种药物载体，可以将一些不稳定、易氧化的药物包封在脂质体中，药物因受到脂质体双层膜的保护，在很大程度上提高了药物的稳定性，又解决了难溶性药物的溶解性，延长了和厚朴酚在血液中的半衰期。同时利用肿瘤新生血管的增强渗透和滞留（EPR）效应，使药物借助纳米脂质体递药系统往肿瘤部位靶向递药。本研究设计将和厚朴酚包裹于脂质体中，改善和厚朴酚稳定特性和溶解性；同时利用肿瘤EPR被动靶向作用提高和厚朴酚的治疗效果；以包封率为指标，采用正交实验筛选并优化了其处方和制备工艺，旨在探索包封率高、缓控释给药的和厚朴酚脂质体。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 采用RE-52型真空旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；超声波细胞粉碎仪（宁波新芝器仪研究院）；粒径与ζ电位分析仪（model 380XLS，Nicomp TM，Santa Barbara，CA，USA）；岛津高效液相色谱系统；岛津SPD-10A紫外检测器；3K透析袋（绿鸟科技）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；超滤管（MW 3000，Millipore）；XW280A 型旋涡混合器（上海青浦沪仪器厂）；透射电镜（Joel JEM-1230，Japan）。

1.2 试剂 大豆卵磷脂（上海太伟药业）；胆固醇购于美国sigma公司；和厚朴酚（深圳美荷生物科技有限公司）；甲醇（色谱纯）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 和厚朴酚脂质体的制备 采用薄膜水化-挤出法制备和厚朴酚脂质体：精密称取大豆卵磷脂、胆固醇、和厚朴酚置于茄形瓶中，加入乙酸乙酯使脂质完全溶解。将茄形瓶置旋转蒸发仪上，40℃减压蒸发有机溶剂，使脂质溶液形成一层均匀薄膜。真空干燥过夜，使溶剂除尽。加入磷酸盐缓冲液（PBS）水化，探头超声。水化液经 0.80、0.45、0.22 μm 滤膜高压挤出，得和厚朴酚脂质体混悬液，置于4℃冰箱保存备用。

2.2 和厚朴酚脂质体包封率测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：大连依利特C18柱（150 mm×416 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -水 -冰乙酸（70∶30∶0.2）；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：254 nm；柱温：25℃。

2.2.2 标准曲线绘制 配制质量浓度为0.5、2.0、5.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg/mL 的一系列和厚朴酚对照品溶液。按上述色谱条件进样，以峰面积和质量浓度进行线性回归，得回归方程A=54 610－2 125.8（R2=0.999 8），在 0.5～20.0 μg/mL 浓度范围内线性关系良好，精密度和回收率均符合分析要求。

2.2.3 包封率测定 和厚朴酚脂质体包封率测定采用超滤法：精密移取0.3 mL脂质体胶体溶液于超滤管中，离心10 min，吸取下层液，甲醇稀释后，取20 μL按照2.2.1条件测定药物含量。计算未包封的和厚朴酚量（M1）。另外精密移取0.3 mL脂质体胶体溶液，用甲醇破乳后测定和厚朴酚，计算胶体溶液中和厚朴酚量（M2），计算包封率（EE%），计算公式为 EE%=（M2－M1）/M2。

2.3 正交试验优化和厚朴酚脂质体质体处方 脂质体制备工艺因素及处方因素都会影响脂质体的药物包封率，所以，本研究在前期试验时采用单因素分析方法考察薄膜分散法制备和厚朴酚脂质体的一些工艺和处方条件，在单因素考察的基础上，通过正交设计试验优化和厚朴酚脂质体处方和制备工艺。

2.3.1 因素和水平的选择 在单因素考察的基础上，以脂质体的包封率为考察指标。选择影响脂质体包封率的主要因素：磷脂与药物的重量比（A）、磷脂与胆固醇的重量比（B）、水相介质种类（C）及超声时间（D）4个对包封率影响较大的因素作为考察因素，每个因素设3个水平。见表1。

表1 因素水平表

2.3.2 正交试验结果分析 选用L9（34）正交试验设计表安排9次试验，制得和厚朴酚脂质体，分别测定和厚朴酚包封率。见表2。根据正交试验表，从极差R来看，各因素对包封率的影响大小次序为：A＞B＞C＞D。在试验所选的范围内，超声时间对和厚朴酚包封率的影响最小，磷脂与药物的重量比对包封率影响最大。根据实验结果，并综合经济原则，最后确定最佳工艺和处方条件为A1B1C3D1，即磷脂与药物的重量比为60∶1，磷脂与胆固醇的重量比为20∶1，水化介质为pH 6.5磷酸盐缓冲液，超声时间为6 min。

2.4 工艺验证 为了进一步验证上述优化处方和工艺的稳定性和可行性，以优化出的最佳工艺进行3次验证实验，和厚朴酚包封率结果可从表3中看出，用优化后的处方和工艺制备的和厚朴酚脂质体包封率比其他正交试验的结果都更好，说明优化成功，优化处方和工艺稳定、可行。见表3。

表2 L9（34）正交试验设计结果

表3 验证试验结果

2.5 酚脂质体理化表征 采用上面优化的处方和工艺条件制备和厚朴酚脂质体，通过测定粒径和体外药物的累积释放率对其物理化学性质进行表征。

2.5.1 粒径分布 采用粒度/Zeta电位测定仪，测定和厚朴酚脂质体的粒径分布。为防止多散射现象，样品均用去离子水稀释至适当浓度后测定。结果和厚朴酚脂质体粒径呈现正态分布趋势，平均粒径为150 nm左右，非常有利于通过EPR效应进入肿瘤组织。

2.5.2 和厚朴酚脂质体体外释放 采用透析法考察和厚朴酚脂质体的体外释放行为。释放介质为含0.5%吐温-80的PBS溶液[6]。取1 L和厚朴酚脂质体溶液加入到预溶胀的透析袋内（MWCO=5 000 Da），扎紧袋口，放入装有50 mL释放介质的容器中，于37℃恒温水浴，100 rpm振荡下进行释放实验。按照预先设定时间从释放介质中取样0.5 mL，同时补入等量37℃空白释放介质。采用HPLC法测定释放样品中的和厚朴酚浓度，以和厚朴酚的DMSO溶液作为对照。结果和厚朴酚DMSO溶液体外释放快且释放完全，说明透析袋对和厚朴酚吸附较少，可以用来评价和厚朴酚脂质体的体外释放行为。和厚朴酚脂质体无明显突释现象，呈现出缓慢释放，尤其是24 h几乎接近零级释放。所以和厚朴酚脂质体不仅可以改善和厚朴酚稳定性和溶解性能，还具有缓控释性能，为开发和厚朴酚的缓控释制剂提供一定的借鉴作用。

3 讨论

脂质体制备过程中常常遇到包封率不高等问题，通过前期预试验发现，影响脂质体包封率的因素是多方面的。因此，本实验我们选取部分重要影响因素，通过正交试验设计和分析，优化出高包封率的工艺和处方因素，并对优化出来的和厚朴酚脂质体进行体外理化性能的表征。本实验制备的和厚朴酚脂质体为普通脂质体，如果对其表面进行适当修饰，可以得到预期各种功能性脂质体。比如对磷脂进行聚乙二醇（PEG）修饰后，可以得到长循环脂质体；各种抗原-抗体修饰可以制备各种免疫脂质体。这些修饰的脂质体更能够发挥药物在体内缓控释及靶向效应。

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