基于金纳米颗粒的比色法检测大肠杆菌O157∶ H7

周丽霞， 肖 勇， 杨耀东

(中国热带农业科学院椰子研究所，海南省热带油料作物生物学重点实验室，海南 文昌571339)

大肠杆菌(Escherichia coli)O157∶ H7 属于肠杆菌科埃希氏菌属，是一种毒性较强的食源性病原菌，主要通过饮用水、牛奶等食品进行传播［1-5］，人体感染该类病原菌会患有腹泻、出血性结肠炎等疾病，此外还可引发溶血性尿毒综合症及血栓性血小板减少紫斑等严重并发症，严重者可导致死亡［6-7］。因此，快速、灵敏的检测和分析此类感染性病原菌对于疾病防治、环境保护等都具有十分重要的意义。传统的病原菌检测方法通常建立在免疫学和细菌分离的基础上，如细胞计数法、酶联免疫吸附法、PCR 分析法等，该类方法具有较高的准确度，但也存在很多缺点，如细菌培养费时，检测不灵敏，分离过程中造成菌数目的损失等［8-10］。因此，传统的检测方法已远不能满足现代生活和医学应用中对大肠杆菌O157∶ H7 快速灵敏检测的要求，探索一种快速、灵敏、低成本和易操作的病原菌检测新方法对于预防疾病传播和环境保护都具有深远的意义。

随着纳米科技与生物学的深入发展，金纳米颗粒作为纳米材料的重要成员之一，其在量子尺寸效应、光稳定性和生物相容性等方面的独特优势，已在微生物和细胞检测领域得到了广泛应用［11］。本试验利用抗体功能化金纳米颗粒与大肠杆菌之间的聚合，发展了一种基于金纳米颗粒的比色法，并用此方法分别对缓冲液体系和矿泉水中大肠杆菌O157∶H7 进行快速检测，以期为多种食源性病原菌的快速、灵敏检测提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

HAuCl4购于天津市化学试剂研究所;柠檬酸三钠购于天津市化学试剂一厂;多克隆羊抗大肠杆菌O157∶ H7 抗体、溶菌肉汤(LB)培养基、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC·HCl)购于北京鼎国生物科技有限公司;E.coliO157∶ H7 购于广州环凯生物科技有限公司;E.coliO149 购于广东省微生物研究所;E.coliDH5α 购于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。

JEOL-1230 型透射电子显微镜购自日本JEOL公司;高速离心机购于日本Hitachi 公司;纳米粒度及Zeta 电位仪(Nano-ZS)购于英国Malvern 公司;Lambda 900UV 光谱仪购自Perkin Elmer 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 金纳米颗粒的制备、生物修饰及表征 参照文献［12］报道的方法制备金纳米颗粒，在100 ml 的烧杯中，加入浓度为0.01%的氯金酸50 ml，加热搅拌至沸腾后，加入浓度为1.00%的柠檬酸三钠2 ml，继续保持沸腾并反应15 min，溶液颜色变为酒红色，停止加热并使其自然冷却至室温，即合成了金纳米颗粒。

参照文献［13］、［14］方法进行纳米颗粒的生物修饰。取1 ml 金纳米颗粒溶液，离心后去掉上清液，向体系中加入10 μl 巯基丙酸，轻轻混匀后室温下放置4 d，高速离心后用pH 为7.4 的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次，然后将颗粒分散在1 ml PBS 中。向体系中加入3.5 mgNHS，于25 ℃下反应30 min，再加入50 μl 1 mg/ml 的多克隆羊抗大肠杆菌O157∶ H7抗体和3.5 mg EDC·HCl，于25 ℃下反应3 h，待反应终止后离心除去上清液，然后分散在PBS 缓冲液中，并避光于4 ℃保存。采用纳米粒度仪及Zeta 电位仪、透射电镜和紫外吸收对修饰前后的颗粒进行表征［15］。

1.2.2E.coliO157∶ H7 的培养 将含有0.5 g 酵母提取物、1.0 g 蛋白胨和0.5 g NaCl 的LB 培养基粉末溶于100 ml 水中，于121 ℃下高温灭菌30 min［16］。分别将E.coliO157∶ H7、E.coliO149 和E.coliDH5α 在液体培养基中于37 ℃培养2.5 ～3.0 h，用涂板计数法计算初始菌浓度，并将培养好的菌悬液放在4 ℃保存。

1.2.3E.coliO157∶ H7 的检测 将1 ml 6.3 ×106个E.coliO157∶ H7 菌悬液8 000 r/min离心5 min，去除上清液后，加入1 ml pH 为7.4 的PBS 缓冲液冲洗2 次，并最终将菌充分分散在1 ml PBS 缓冲液中。根据梯度浓度稀释法，得到浓度为1 ml 6.3 ×101～6.3 ×106个菌悬液。

分别取100 μl 终浓度为9.3 mg/ml的抗体功能化金纳米颗粒，加入400 μl 上述不同浓度的菌悬液，于37 ℃恒温培养箱中孵育1 h。根据抗原-抗体的免疫特异性结合，原本分散的金纳米颗粒集中聚合在菌的表面，根据金纳米颗粒的尺寸效应，使得混合体系的颜色发生变化。由于缓冲液中目标菌的浓度不同，颗粒的聚合程度也不同，混合体系的颜色也逐渐由红色变为蓝色，从而实现了对大肠杆菌O157∶ H7快速、直观地检测。

1.2.4 食品中大肠杆菌O157∶ H7 的检测 为考察该检测方法的实用性，从当地超市买了瓶装矿泉水，人为加入目标菌后直接使用。将1 ml 4.1×106个E.coliO157∶ H7 菌悬液8 000 r/min离心5 min，去除上清液后，加入1 ml 矿泉水冲洗2 次，并最终将菌充分分散在1 ml 矿泉水中。根据梯度浓度稀释法，得到浓度为1 ml 4.1×101～4.1×106个菌悬液。

2 结果与分析

2.1 金纳米颗粒的表征

合成的金纳米颗粒形貌如图1 所示，颗粒呈规则的球形，大小均匀且分散性较好，另外，纳米粒度仪测定出金纳米颗粒的平均直径约为(12.3 ±2.0)nm，该结果与电镜图的大小基本吻合，有利于颗粒的下一步应用。图2 为金纳米颗粒修饰巯基丙酸前后的吸收光谱，测得其最大荧光发射峰位于520 nm左右。当颗粒表面修饰了巯基丙酸后，表面有大量的羧基基团，其电位约为-44.7 mV(图3)，这一结果表明，颗粒表面成功地修饰了大量巯基丙酸。

图1 金纳米颗粒的透射电镜图Fig.1 Transmission electron microscopic(TEM)image of gold nanoparticles

图2 金纳米颗粒修饰前后的吸收光谱图Fig.2 Absorption spectrum of gold nanoparticles and modified gold nanoparticles

图3 羧基化金纳米颗粒的Zeta 电位图Fig.3 Zeta potential spectrum of carboxyl modified nanoparticles

2.2 大肠杆菌O157∶ H7 的检测

2.2.1 可行性考察 基于金纳米颗粒的比色法对1 ml 6.3 ×105个大肠杆菌纯培养物阳性对照和阴性对照(阴性对照1:以无菌缓冲液取代大肠杆菌O157∶ H7;阴性对照2:以裸金纳米颗粒取代功能化金纳米颗粒)进行可行性考察。结果显示，在阳性对照组中，抗体功能化金纳米颗粒与目标菌共孵育后，体系颜色变为蓝色，而在2 个阴性对照中，体系颜色仍为红色，几乎没有发生颜色变化，这一结果说明该方法检测大肠杆菌O157∶ H7 是可行的，同时表明抗体与金纳米颗粒的交联效果较好。

2.2.2 大肠杆菌O157∶ H7 的检测结果 基于金纳米颗粒的比色法对梯度浓度为1 ml 6.3 ×101～6.3 ×106个大肠杆菌O157∶ H7 进行检测，通过溶液颜色的变化，来考察方法的检测灵敏度。结果显示，当菌液浓度为1 ml 6.3 ×102个时，体系颜色由红色变为紫色，随着菌浓度的增大，颜色逐渐变为蓝色，因此，该方法检测下限为1 ml 6.3 ×102个大肠杆菌O157∶ H7。为进一步验证这一结果，取适量浓度为1 ml 6.3 ×103个大肠杆菌O157∶ H7 与功能化金纳米颗粒的混合液滴在铜网上，室温下放置24 h 阴干，在透射电镜下观察金纳米颗粒与大肠杆菌O157∶ H7的形态(图4)，发现大肠杆菌O157∶ H7表面成功聚集了一定量的金纳米颗粒。

图4 金纳米颗粒与大肠杆菌O157∶ H7 的透射电镜图Fig.4 TEM image of the mixture of E.coli O157 ∶ H7 and gold nanoparticles

2.3 检测方法的特异性考察

为进一步评价该检测方法的特异性，现分别采用E.coliDH5α(1 ml 5.7 ×105个)和E.coliO149(1 ml 7.2 × 105个)作为非目标菌，与大肠杆菌O157∶ H7经过同样的处理方法后，加入抗体功能化金纳米颗粒，并于37 ℃恒温孵育1 h。考察结果显示，当分别采用无菌缓冲液、E.coliO149、E.coliDH5α 代替目标菌(E.coliO157∶ H7)时，体系颜色均未发生变化，而加入大肠杆菌O157∶ H7 时，体系颜色从红色变为蓝色，由此可见，该方法的检测特异性较好。同时，我们测定了每个体系的紫外吸收光谱，如图5 所示，当体系中加入大肠杆菌O157∶ H7时，金纳米颗粒520 nm 吸收峰降低，随着颗粒的聚集程度增大，在630 nm 出现新的吸收峰。表明只有大肠杆菌O157∶ H7 诱导金纳米颗粒聚集，而其他非目标菌未与功能化颗粒结合，这一结果进一步证明该方法具有较好的检测特异性，未出现抗体与非目标菌的交叉反应。

图5 不同菌存在时金纳米颗粒的吸收光谱Fig.5 Absorption spectra of gold nanoparticles in the presence of different bacteria

2.4 食品中大肠杆菌O157∶ H 7 的检测

为证明基于金纳米颗粒的比色法可用于检测食品中的大肠杆菌O157∶ H7，用矿泉水配制了400 μl终浓度为1 ml 4.1 × 101～4.1 × 106个大肠杆菌O157∶ H7，并分别加入100 μl 抗体功能化的金纳米颗粒，于37 ℃恒温中孵育1 h。结果显示，当菌浓度为1 ml 4.1 ×102个时，体系颜色由红色变为紫色，随着菌浓度的增大，体系颜色逐渐变为蓝色。为进一步证明该检测方法的灵敏度，分别对1 ml 4.1 ×101个和1 ml 4.1 ×102个菌浓度的反应体系进行光谱分析，结果(图6)显示，1 ml 4.1 ×101个菌浓度的反应体系在520 nm 有吸收峰，630 nm 处无锋，而1 ml 4.1 ×102个菌浓度的反应体系在520 nm的吸收峰降低，随着颗粒的聚集程度增大，在630 nm 出现新的吸收峰。表明应用该比色法对矿泉水样本进行检测，其灵敏度为1 ml 4.1 ×102个 大肠杆菌O157∶ H7。

图6 不同浓度大肠杆菌O157∶ H7 存在时金纳米颗粒的吸收光谱Fig.6 Absorption spectra of gold nanoparticles in the presence of different concentrations of E.coli

3 结论

基于抗体功能化的金纳米颗粒，发展了一种直观、简便的比色分析法用于大肠杆菌O157∶ H7 的检测。该方法巧妙的运用了金纳米颗粒的量子尺寸效应，由于聚集程度不同，其吸收光谱发生红移，从而引起溶液颜色发生不同的变化，实现了对缓冲体系和矿泉水中目标菌的快速检测。若采用针对其他病原菌以及细胞的特异性抗体，有望成为一种通用的方法用于食品检测、疾病诊断和环境保护等领域中多种病原菌与细胞的测定与分析。

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