豆渣蛋白提取及检测试验

马秀婷，肖志刚，2，罗志刚，叶玲玲，孙 旭，高 洋，刘海飞

(1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030;2.沈阳师范大学粮食学院，辽宁沈阳110034;3.华南理工大学 轻工与食品学院，广东广州510641)

国内外对大豆副产物的研究大多集中在对大豆压榨完豆油后的渣子豆粕的研究，而文中提到的豆渣是加工完豆腐、豆乳和豆皮等豆制品的副产物，人们往往忽略了对这种副产物的利用.目前国内大豆食品行业每年可产生上千万吨湿豆渣，大豆豆渣中含有较多的蛋白质、膳食纤维、多糖、异黄酮等营养物质［1］，对豆渣蛋白的综合利用可以有效减轻对环境的污染.由于豆渣在加工过程中水溶性的蛋白质已经溶解在具体产品当中，其余的蛋白质几乎都是很难溶于水的，因此对豆渣中剩余蛋白质的提取研究存在很大困难.事实上对蛋白质提取的方法还是比较多的，如碱溶酸沉法、酶法、反胶束法、盐析法等［2］，目前大多提取蛋白方法是单一方法进行的，并且上述方法中都或多或少存在蛋白提取率低、蛋白纯度达不到要求和所得蛋白加工性能降低等弊端.

超声波作为一种辅助手段提取豆渣蛋白，具有费用低、毒副作用小、作用时间短及对产品营养性能影响较小等优点.由于豆渣蛋白分子结构复杂，影响豆渣蛋白功能性质因素也十分复杂.所以不仅要进一步对豆渣蛋白提取工艺进行研究，还要加强豆渣蛋白基础研究.目前通过对豆渣蛋白SDS-PAGE凝胶电泳，氨基酸组成和溶解性分析来衡量豆渣蛋白的变性程度［3-5］，文中为了证实碱溶酸沉法和超声波辅助提取的豆渣蛋白相比是否存在变性，对豆渣蛋白的溶解性进行考察，即对豆渣蛋白的PDI和NSI进行测定，为提高大豆豆渣中蛋白提取率，采用超声波和碱溶酸沉共同作用的方法进行研究.

1 材料与方法

1.1 材料、药品和相关仪器

大豆豆渣来自哈尔滨阿幸豆制品加工厂，体积分数为98%浓硫酸、95%乙醇、氢氧化钠、盐酸、硼酸等均为分析纯.Analysenmuhce A10冷却式粉碎机(德国W-Germany公司);JY92超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);722可见光分光光度计(上海青华科技仪器有限公司);MA40电子分析天平(德国Sartorius公司);LD4-2A离心机(北京医用离心机厂);电热恒温水浴锅(余姚市东方电工仪器厂).

1.2 豆渣主要成分检测

蛋白质含量检测:GB/T5009.5—2010，凯氏定氮法;纤维素含量检测:GB/T5009.10—2010，重量法;淀粉含量检测:GB/T5009.9—2008，酸水解法;灰分含量检测:GB/T5009.4—2010，灼烧恒重法;水分含量检测:GB/T5009.3—2010，105 ℃ 恒重法;脂肪含量检测:GB/T 5009.6—2010，索氏抽提法.

1.3 试验方法

经预试验确定大豆豆渣蛋白提取的技术路线，见图1.

图1 豆渣蛋白提取技术路线

蛋白提取率的计算如下:

1.4 豆渣蛋白等电点的测定

取过100目筛的豆渣粉50 g，在料液质量浓度22 mL·g-1，45℃下用1 mol·L-1NaOH溶液调节pH值至9.5，搅拌提取1 h，提取过程中要不断向溶液中加入1 mol·L-1NaOH保证体系的pH一直是9.5 不变，8 000 r·min-1离心 10 min，取上清液，用量筒平均分成10份，再用1 mol·L-1的HCI调节溶液的 pH 至 4.0，4.2，4.4，4.6，4.8，5.0，5.2，5.4，5.6，5.8，6.0，静止 2 h 后 8 000 r·min-1离心 10 min，检测沉淀蛋白质的质量，以pH为横坐标、以沉淀蛋白质的质量与原液质量的百分比K为纵坐标绘制曲线图，得到不同pH条件下对豆渣蛋白沉淀质量的影响，从而确定其等电点.

1.5 提取条件的确定

相关学者研究［6-10］发现，超声波辅助提取的主要影响因素有液料比、温度、超声时间、超声功率，故本试验对这4个因素采用Sigma Plot软件进行单因素分析，通过单因素试验获得豆渣蛋白提取率最优参数组合.

经预试验已得出超声辅助碱溶酸沉法的蛋白提取率远远大于碱溶酸沉法的蛋白提取率.准确称取10 g豆渣粉末，用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节体系 pH 值为 7.5，8.5，9.5，10.5，在不同条件下进行超声辅助碱溶酸沉法提取豆渣蛋白试验，并用微量凯氏定氮法检测蛋白含量.

根据预试验和参考文献［11］，固定其他因素考查某一因素的变化情况，进行以下单因素试验.各个因素固定值为液料比22 mL·g-1、温度45℃、超声时间30 min、超声功率500 W，考查各因素对蛋白提取率影响的单因素变化值分别为液料比18，20，22，24，26，28，30 mL·g-1;温度 35，40，45，50，55，60 ℃;超声时间 10，20，30，40，50，60 min;超声功率100，200，300，400，500，600，700 W.每一单因素试验点做3组平行对照.例如考核料液比对豆渣蛋白提取率影响时，固定其他因素条件为温度45℃、超声时间30 min、超声功率 500 W，液料比为 18，20，22，24，26，28，30 mL·g-1.考查其他相关因素时与此类似.

1.6 豆渣蛋白热力学性质

称取3 mg的豆渣蛋白样品于小铝盒中，以未装任何物质压缩空铝盒作为空白对照，检测条件:扫描温度范围30～40℃，升温速率为30℃·min-1，气氛为氮气，流率为30 mL·min-1，进行DSC扫描试验，记录DSC曲线.最终确定出豆渣蛋白变性焓值和变性温度.

1.7 SDS-PAGE凝胶电泳检测

分离胶含 10%Acr，0.15%Bis，0.57 mol·L-1Tris-HCl，0.1%SDS，pH 为 8.8，浓缩胶含 3.3%Acr，0.5%Bis，0.18 mol·L-1Tris-HCl，0.1%SDS，pH 为6.8.电极缓冲液含 Tris0.023，甘氨酸 1.44%，SDS 0.1%，pH 为 8.0.

1.8 豆渣蛋白氨基酸组成分析

准确称取20.00 mg样品于一端封口的小玻璃管中，加入8 mL 6 mol·L-1HCl于水解管中，再将上述玻璃管开口朝上置于水解管中，注意不要使盐酸漫过水解管边缘.首先将水解管真空脱气、再氮气封管，利用盐酸蒸气在110℃下对样品进行水解，体系反应24 h后将水解液取出，再将其真空干燥，减压的过程中除去水解液残留的盐酸.之后将6-氨基哇琳基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯溶液和水解液加入事先准备好的衍生管中，最后进行色谱分析.根据氨基酸标准品色谱分离图计算出所得图谱的氨基酸含量.

1.9 豆渣蛋白溶解指数检测

1.9.1 豆渣蛋白PDI测定

方法参考文献［12］，有改动.准确称取20.00 g豆渣蛋白样品、25℃蒸馏水于300 mL容量瓶中，取其50 mL于搅拌杯，将称好的豆渣蛋白定量移入搅拌杯，用刮铲搅拌至糊状，用剩余水不断冲洗搅杯壁和刮铲，之后8 000 r·min-1搅拌10 min，将浆液移入500 mL烧杯中，静止5 min，取40 mL于50 mL离心管中在8 000 r·min-1离心20 min，随后采用GB/

1.9.2 豆渣蛋白NSI测定

方法参考文献［13］，有改动.准确称取5.00 g豆渣蛋白样品，置于500 mL烧杯中，用量筒量取200 mL 30℃的蒸馏水，分几次加入到烧杯中，样品混合后将其浸在30℃水槽中，120 r·min-1搅拌100 min再将混合物转到250 mL容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，静止5 min，取40 mL于50 mL离心管中在8 000 r·min-1离心20 min，随后采用 GB/T 5009.5—2010微量凯氏定氮法测定上清液中可溶解氮含量和样品总氮含量，则T 5009.5—2010微量凯氏定氮法测定上清液分散蛋白质和样品总蛋白质含量，则

2 结果与讨论

豆渣蛋白等电点检测结果见图2.

图2 豆渣蛋白等电点检测

在pH5.4处，豆渣蛋白质沉淀量最多，这主要是因为豆渣蛋白是肽键脱水缩合而成，虽然豆渣蛋白内部的α-羧基和α-氨基残基在形成脱水缩合过程中消除，但是某些氨基酸的残基仍可电离，使得豆渣蛋白分子所带静电荷仍可随溶液pH的变化而变化.根据等电点处蛋白质溶解度最小原理，测得豆渣蛋白质等电点为pH5.4，这也说明豆渣蛋白具有特定氨基酸种类和数量.

基本成分质量分数测定结果为蛋白质(13.02±0.09)%;纤维素(71.93 ±0.32)%;淀粉(3.17 ±0.05)%;灰 分 (3.76 ± 0.11)%;水 分 (3.12 ±0.23)%;脂肪(4.01 ±0.06)%，豆渣中主要成分是膳食纤维，其次就是蛋白质，除了上述物质外还可能含有多种维生素、矿物质、胰蛋白酶抑制剂、血球凝结素、糜蛋白抑制剂等，它们含量较少并在豆渣蛋白提取过程中无明显影响.

2.1 液料比对蛋白提取率的影响

液料比对蛋白提取率的影响见图3.

图3 液料比对蛋白提取率的影响

由图3可看出，当温度45℃、超声时间30 min、超声功率500 W时，随液料比增加蛋白提取率呈递增趋势.当液料比较小时，蛋白质扩散速率较低，蛋白质分子和溶液分子之间分布不均匀，导致OH-分布不均匀，阻止体系中蛋白质溶出.但若液料比过大，又会影响到浓缩等后续工作进行.与此同时pH值在7.5～9.5，蛋白提取率逐渐增加，OH-所带的负电荷与蛋白质所带的负电荷彼此排斥，导致蛋白质溶解作用和扩散作用增加［14］，表现为蛋白质溶解度增加;pH值在9.5～10.5，蛋白提取率却明显下降，原因是当pH值超过10后，会出现脱氨、脱羧和肽键断裂等副反应的发生［15］，再者由于OH-占主导作用，使—COO-增加了分子间静电斥力，离散的双电子层加厚，溶液界面膜增厚，易于形成胶束，进而导致蛋白质的溶解和扩散作用降低.因此，液料比22 mL·g-1较为适宜.

2.2 温度对蛋白提取率的影响

温度对蛋白提取率的影响见图4.

图4 温度对蛋白提取率的影响

由图4可知，当液料比22 mL·g-1、超声时间30 min、超声功率500 W时，在温度从35～50℃，蛋白提取率呈增加趋势，而最初蛋白提取率较低，因为此时溶剂的动能尚未达到将蛋白质从豆渣颗粒中分离出来的水平，而后升高温度，蛋白提取率不断增大，这是因为随着温度的升高，使豆渣蛋白的溶解和扩散程度均呈增加趋势.但当温度超过55℃，蛋白提取率又呈下降的趋势，pH值在7.5～9.5，蛋白提取率逐渐增加，原因是碱液使蛋白与其他成分紧密结构变得疏松，对蛋白质分子具有增溶作用，随着pH值增加，豆渣蛋白提取率呈递增趋势.因此，温度50℃较为适宜.

2.3 超声时间对蛋白提取率的影响

超声时间对蛋白提取率的影响见图5.

图5 超声时间对蛋白提取率的影响

由图 5可知，当液料比 22 mL·g-1、温度45℃、超声功率500 W时，随超声时间增长和pH值在7.5～9.5，豆渣蛋白质分子在碱液中溶解度不断增加，pH 值在9.5～10.5，蛋白提取率降低，此时随超声时间延长蛋白提取呈递增趋势，最终达到一个平衡值，几乎不再发生变化.这是因为随超声时间增加，蛋白质的溶出和扩散速度都不断增加，表现为豆渣蛋白质分子在体系中的溶解度不断增加，当时间大于30 min，pH值大于9.5，整个体系的渗透压达到平衡，体系组分不再溶出.因此，超声时间30 min较为适宜.

2.4 超声功率对蛋白提取率的影响

超声功率对蛋白提取率的影响见图6.

图6 超声功率对蛋白提取率的影响

如图6所示，当液料比22 mL·g-1、温度45℃、超声时间30 min时，随超声功率增加，豆渣蛋白提取率逐渐增加，最后趋于平缓，这是由于超声功率增大，可产生强烈空化、湍动、微扰、界面等效应，从而提高了蛋白质分子的质量传递能力.当超声强度达到或超过空化阀声压，此时空化作用明显，豆渣蛋白提取率增加，并且蛋白质溶出量远远超过其他杂质，表现为蛋白提取率增加.在超声功率为100 W和700 W时，分别面临着豆渣蛋白提取率较低和蛋白质变性失活的弊端，所以在响应面试验时不将超声功率为100 W和700 W的点列入可以考查的参数范围，进而使研究的结论更加清晰和突出.而pH 值7.5，8.5，9.5所对应的蛋白提取率几乎都高于pH值10.5时蛋白提取率.因此，超声功率400 W较为适宜.综上所述，当pH值为9.5时，豆渣蛋白提取率几乎都高于其他条件，因此进一步试验时pH值选为9.5.

2.5 豆渣蛋白热力学性质测定

如图7和8所示，蛋白质变性与其焓值的变化是伴随发生的，可利用DSC分析提取豆渣蛋白的热变性温度.当蛋白质没有发生变性时，是一种天然、有序的结构，由DSC测得的吸热焓值△H较大;而一旦发生变性，蛋白分子会由有序结构转变为无序结构，吸热焓值△H随之变小.由图可见，碱溶酸沉和超声波辅助所得的豆渣蛋白变性温度均为98.65℃，两者的热焓值分别为20.09 J·g-1和19.39 J·g-1，两者相差不大，说明超声波的辅助作用几乎未引起豆渣蛋白的变性.

与此同时，DSC的图谱可以提供比较多的信息，如分子间相互作用、溶剂条件的不同对变性的影响，以及加工条件的不同对蛋白质功能性质分析的影响等.

图7 碱溶酸沉豆渣蛋白DSC曲线

图8 超声波辅助豆渣蛋白DSC曲线

2.6 豆渣蛋白SDS-PAGE电泳图

豆渣蛋白SDS-PAGE电泳图见图9.

图9 2种蛋白的SDS-PAGE电泳图

图9中，标示2泳道为超声波辅助提取豆渣蛋白电泳图谱，其浓缩胶中的颜色较标示1泳道碱溶酸沉所得豆渣蛋白稍微加深，可能是因为超声处理产生的“空穴作用”使得豆渣蛋白分子发生轻度交联，而两方法所得豆渣蛋白在分离胶中的电泳区带几乎相似，分子量没有什么变化，其区带的颜色深浅差别不明显，这说明在超声作用得到的豆渣蛋白并没有产生亚基的断裂.

2.7 豆渣蛋白氨基酸组成和分析

2种试验方法所得豆渣蛋白氨基酸组成和质量分数如表1所示，由表可知两者氨基酸含量相差不大.豆渣蛋白氨基酸组成丰富，其中谷氨酸含量最高为17.65%左右，天冬氨酸为9.91%左右，再之后就是亮氨酸为7.58%左右.

表1 2种方法所得豆渣蛋白氨基酸组成分析结果 %

2.8 豆渣蛋白溶解性分析

不同质量分数的豆渣蛋白对其PDI和NSI有重要影响，结果见图10.

图10 蛋白质量分数对豆渣蛋白PDI和NSI影响

无论是单一碱溶酸沉法提取的豆渣蛋白还是超声波辅助碱溶酸沉提取的豆渣蛋白都存在PDI值高于NSI值，后者提取的豆渣蛋白的PDI值要大于前者的PDI值，2种方法得到蛋白的PDI值和NSI值都随豆渣蛋白浓度的增加呈现升高趋势，这是因为豆渣蛋白的主要组成为球蛋白，其为紧密的椭圆状分子，亲水性的侧链和基团多分布于其表面［16］.然而随豆渣蛋白质量分数的增加，体系中不溶解蛋白逐渐增加，致使体系的表面黏度提高;再者因为当豆渣蛋白质量分数大于8%时，其分子聚集和相互作用亦加剧，最终聚集为厚厚的索状进一步形成凝胶，导致PDI和NSI呈降低趋势.当蛋白质量分数为6%左右时PDI达到最大值，蛋白质量分数为5%左右时NSI达到最大值，这可能是因为豆渣蛋白特定的分子结构、分子表面和电荷性以及亲水性决定的.综上所述超声处理可破坏蛋白与纤维之间的结合程度，使一些蛋白质易于溶出，远远大于不溶出的量进而抵消变性的程度;再者在增大蛋白提取率的同时豆渣蛋白溶解性变化不大，可说明本试验采用的超声波辅助碱溶酸沉提取豆渣蛋白较单一碱溶酸沉法相比并没出现特别大程度的变性.

3 结论

1)本研究表明影响蛋白提取率的先后顺序为超声时间、超声功率、温度、液料比.

2)豆渣蛋白提取率较高时各参数取值范围是液料比20.5 ～22.1 mL·g-1，温度 51.0 ～53.4 ℃，时间28.8 ～30.7 min，超声功率 398.1 ～399.3 W，在此条件下可获得较高的蛋白提取率，经多次试验验证豆渣蛋白提取率可达到80.19%.

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