NO及TNF-α在SD大鼠慢性末端回肠炎发病过程中的变化及意义

周红梅，周国华，周红宇，张 晖，邱亚娟，冷明芳，王 为，颜 君

(湖南师范大学附属湘南医院，衡阳169 医院消化内科，湖南 衡阳 421002)

慢性末端回肠炎(chronic triminal ileitis，CTI)是一种末端回肠的慢性非特异性浅表性炎症。慢性末端回肠炎的病因及发病机制目前多数学者认为与感染、免疫、结肠-回肠反流、食物过敏、药物等有关［1］。采用SD 大鼠行回肠-盲肠侧侧吻合术，去除回盲瓣作用，造成结肠-回肠反流，造成回肠末端的内环境变化，刺激淋巴系统发生免疫反应，继而产生炎症性损害，这是构建慢性末端回肠炎的基本理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型的制作

健康、清洁级SD 大鼠90 只，均为雄性，体重为250 ～350 g ，随机分为造模组、手术缝线组、对照组各20 只，2、8 周每组各取10 只。动物模型的制作［2］。术前禁食12 小时，用3 ﹪戊巴比妥钠0.3 ～0.4 mL 腹腔麻醉。在无菌条件下行腹部手术，剖腹寻找回盲部，采用回肠末端与盲肠侧侧吻合术。缝线组只在末端回肠处作手术缝线，对照组不作处理，但三组SD 大鼠的进食结构、时间相同。分别于术后2、8 周采血后处死动物。

1.2 组织的获取与保存

静脉采血后破腹暴露全腹，低温条件下快速取回肠末段组织距吻合口1cm 处取材［1］0.3 ×1.5cm，以冰冷的生理盐水冲洗，除去血液和粪便，10%中性甲配液固定，常规石蜡包埋，行HE(苏木素-伊红)染色做病理组织学检验，取组织50 mg 用于RNA 的提取。

1.3 回肠组织损伤大体形态和组织学形态评分方法

参照Theresa 的评估标准［3］。NO 检测试剂盒碧云天生物技术研究所(S0021)。TNF-α 的引物合成均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.4 统计分析

实验所有数据应用SPSS 15.0 for windows 统计软件进行统计分析。结果均运用完全随机设计成组资料的方差分析(One-Way ANOVA)进行统计分析，Levene 法方差齐性检验，当各组方差齐时用S-N-K法进行均数间的两两比较，当各组方差不齐时用Dunnett's C 法进行均数间的两两比较。取P ＜0.05为显著性水平。相关性用直线相关分析。

2 结果

2.1 回肠末端大体肉眼观察

造模组死亡1 只。2 周时造模组与缝线组末端回肠均出现明显急性炎症反应的表现，二组相比炎症评分无统计学差异(P ＞0.05)。8 周时造模组出现肠管水肿扩张、粘连、狭窄，少部分出现糜烂，而缝线组肠管与对照组相比差异无显著性(P ＞0.05)，造模组与缝线组相比差异有显著性(P ＜0.05)。

表1 实验动物末端回肠肉眼炎症评分比较

2.2 回肠末端镜下病理观察

2 周时，缝线组与造模组均为急性炎症表现，毛细血管、淋巴管、乳糜管明显扩张，炎症细胞浸润以中性粒细胞及嗜酸性粒细胞为主，上皮明显脱落，绒毛变粗变短。病变主要侵及粘膜层，炎症评分两组均有增加，但缝线组低于造模组(P ＜0.05)。8 周时，造模组为明显慢性炎症表现:局部绒毛变粗变短部分脱落，充血、出血，淋巴管、乳糜管扩张，炎症细胞浸及粘膜及粘膜下层，粘膜下结构破坏，毛细血管增生，部分糜烂及浅溃疡形成。8 周时缝线组上皮完整，成纤维细胞增生，基本正常，与对照组的炎症评分无明显差异(P ＞0.05)。

表2 实验动物末端回肠光镜下炎症评分比较

2.3 血清中NO 的含量

慢性末端回肠炎造模后2 周，血清中的NO 增加(P ＜0.05)，且随着病程的延长明显增多(P ＜0.05)，8 周时达高峰;缝线组2 周时较正常组比较有所增加，但无显著性差异，明显少于造模组(P ＜0.05)，随后随着时间的延长而下降，8 周时已与对照组无明显统计学意义(P ＞0.05)(见表3)。NO浓度与炎症评分相关系数0.964，二者呈正相关性(P ＜0.05)。

表3 各组大鼠血清中NO 含量的比较

2.4 TNF-α 的表达

免疫组化显示TNF-α 在造模组中蛋白表达率均较正常对照组肠黏膜升高。肠粘膜组织中TNF-α的阳性细胞弥漫性分布于固有层内，为细胞核或胞浆着色，呈棕黄色至棕褐色(见图1)。2 周时，对照组、造模组、缝线组末端肠组织的TNF-α 表达率分别为10.0%，80.0%，70.0%，三组比较，造模组、缝线组中TNF-α 表达率均较对照组高。8 周时，对照组、造模组、缝线组大鼠末端回肠TNF-α 表达率分别为10.0%，90.0%，40.0%，造模组中TNF-α 表达率较对照组、缝线组均高。见表4。

表4 2 周及8 周三组大鼠末端回肠粘膜TNF-α 表达率对比(Fisher 概率法)

图1 各组TNF-α 的表达

3 讨论

慢性末端回肠炎(CTI)主要表现为腹痛，以右下腹痛为主，腹泻与便秘交替，为稀便或糊状便或羊粪状便，多数患者体重下降不明显。内镜下表现为粘膜充血、水肿、糜烂、出血、浅表溃疡或息肉形成，脆性增加，绒毛分布不均匀，粘膜粗糙呈颗粒状，散在小结节，粘膜变薄，色泽变淡，呈灰红色到灰白色。采用SD 大鼠进行末端回肠-盲肠侧侧吻合术后8周，回肠末端黏膜充血、水肿、出血，镜下发现粘膜及粘膜下层炎性细胞浸润，毛细血管、淋巴管、乳糜管扩张，上皮明显脱落，绒毛变粗变短，粘膜下结构破坏，毛细血管增生，部分糜烂及浅溃疡形成，与临床基本相符［4］。成功构建慢性末端回肠炎动物模型。

NO 为气体自由基，易与氧分子、超氧自由基等反应，参与炎症反应过程，在消化、循环、免疫等全身多系统的生理、病理及有关临床疾病中也发挥重要作用［2］。有许多试验证明［5］，NO 在IBD 及实验性的大肠炎模型发生过程中参与炎症和组织损伤，炎症初期产生小量，可保护胃肠道免受局部缺血和内毒素等引起的各种损伤，随着炎症发展，NO 大量产生可启动机体免疫防御系统，从而造成正常组织损伤，起破坏作用。

慢性末端回肠炎造模后2 周，血清中的NO 增加，NO 使回肠黏膜上皮血管扩张、充血、渗出增多，且随着病程的延长明显增多，8 周时为最高峰;缝线组2 周时较对照组比较有所增加但与造模组比较有明显差异性，随着时间的延长而下降，8 周时已与对照组无明显统计学意义。由此我们推测，2 周时二组NO 均有增加，不排除部分原因为手术操作本身导致肠道损伤后NO 增加。而8 周造模组NO 达高峰。肉眼及镜下炎症评分与NO 浓度呈正相关。

推测NO 在CTI 的肠黏膜中合成增加，影响多种免疫活性物质的合成和分泌，并产生细胞毒功能，参与了CTI 发生、发展。炎症初期产生较少，可抑制激活的巨噬细胞的细胞功能，抑制血小板聚集，保护肠粘膜及促进上皮修复，适当增加肠粘膜的血流。缝线组基础病因不在，且由于少量的NO 更加快了其炎症消退。但造模组随着炎症的发展，产生大量NO，一方面可通过伴随产生的自由基损伤组织，另一方面启动机体免疫防御系统，如巨噬细胞、中性粒细胞、激活NK 细胞、LAK 细胞，增强其细胞毒性，即可造成导致黏膜细胞的损伤［6］，使肠道微环充血，血管通透性增加，肠粘膜充血水肿，甚或渗出糜烂。另由于NO 对整个消化道平滑肌都有舒张作用，且对胃肠移行性复合运动(Migratingmotor complex，MMC)也有影响，其浓度增加必引起了肠道功能率乱，参与了回盲部功能的紊乱，参与慢性末端回肠炎的发病。

TNF-α 主要来源于激活的单核细胞和T 淋巴细胞。其有2 种受体TNFR(tumor necrosis factor receptor)，一种表达于所有类型细胞的TNFR1，另一种仅表达于血细胞和免疫细胞的TNFR2，当TNF 与TNFR 相互作用，TNFR1 相关死亡结构域蛋白，启动丝氨酸/苏氨酸激酶区域，活化IKK，而启动NF-κB信号通路，产生肠道炎症反应［7］，激活免疫细胞产生TNF 等炎症因子，反作用于NF-κB 信号通路，使更多炎症因子表达，进一步加重肠道炎症反应。TNF-α 同其他细胞因子共同参与机体生长发育和维持内环境稳定，同时又介导感染、创伤及免疫应答反应。TNF-α 与炎症的相关性一方面表现在募集白细胞，增加血管、肠壁的通透性，增加促炎性细胞因子来激活免疫细胞;另一方面，TNF-α 上调E-选择素及ICAM-1，并参与粘膜固有层炎性反应及上皮细胞的脱落，导致肠道上皮细胞的通透性增加。

大量研究表明，各类肠道疾病中，TNF-α 含量均有不同水平的升高:CD 患者肠道病变区粘膜及非病变区粘膜TNF-α mRNA 水平均明显升高;腹泻型IBS 患者血清TNF-a 较正常对照组升高。腹泻型IBS 患者血清中可测得低浓度TNF-α，而正常对照组血清中未检测到TNF-α;研究表明TNF-a 与炎症的相关:低浓度的TNF-α 在肠黏膜内通过自分泌或旁分泌方式在局部发挥作用，诱发肠黏膜炎症反应;TNF-α 是增加肠上皮细胞屏障通透性的重要因素;也发现抗TNF-a 抗体可以减少炎症细胞的浸润［8-10］。

在用实验动物模拟CTI 发病的过程中，我们发现末端回肠组织中造模组TNF-α mRNA 表达水平较对照组、缝线组均升高，而且TNF-α 的阳性表达强度与炎症程度呈正相关。术后2 周时，对照组、缝线组、造模组末端回肠组织中TNF-α 的表达率出现逐渐升高的趋势。8 周时，TNF-α 的表达率分别为10.0%，40.0%，90.0%，与2 周时相比，正常对照组TNF-α 的表达率差异无差异，但是缝线组较前降低，造模组较前升高，TNF-α 的表达率与炎症评分呈正相关。术后2 周时，造模组、缝线组TNF-a 平均吸光度值较对照组有所升高，其差异有统计学意义，术后8 周，造模组TNF-α 的平均吸光度值较2 周时明显升高，缝线组较前有所降低，对照组则无明显变化，造模组TNF-α 平均吸光值最高，差异有统计学意义。术后8 周是末端回肠炎炎症最明显时期，同时是末端回肠炎也进入慢性时期，末端回肠粘膜炎症越重，TNF-α mRNA 及TNF-α 阳性表达强度越强，这些均提示TNF-α 在CTI 的发病机制中可能与炎症因子的释放及激活有关。这与文献报道的临床研究及动物实验中的发现基本一致。

CTI 大鼠血清NO 含量变化，造模组大鼠血清水平与对照组相比有显著增高，炎症程度与血清NO 浓度程正相关，说明大量生成的NO 参与了肠组织的损伤，慢性末端回肠炎的腹痛、大便性状改变，结肠功能紊乱可能与NO 的改变有关。NO 可能在慢性末端回肠炎发病中发挥了重要作用。使用NO 相关的拮抗剂或释放剂可能对于CTI 的预防及治疗有效。

通过我们的实验推测，TNF-α 参与了CTI 的发病机制可能是结肠-回肠反流、细菌易位，肠道发生炎症反应。此时，巨噬细胞释放TNF-α，扩大炎症连锁反应造成肠黏膜损伤;TNF-α 还可以活化内皮细胞，改变其细胞表面整合素的表达，促进白细胞、淋巴细胞、血小板黏附到内皮细胞上，提高血管壁通透性，形成微血栓造成肠组织微循环障碍，局部免疫平衡破坏，可激活肠黏膜固有层淋巴细胞，产生促炎细胞因子等，导致肠道炎症和组织破坏。同时，TNF 通过及诱导细胞因子和趋化因子来激活内皮细胞，也能够促进粘膜T 细胞来增加IFN-Y 的产生，两者协同作用，导致上皮细胞碉亡以及上皮屏障破坏，从而促使炎症反应持续存在。另外TNF-α 引起肠上皮细胞屏障通透性增高，可能与蛋白激酶C、NF-κB、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)、丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)等信号途径有关。

［1］周国华，周红宇，龙远志，等. SD 大鼠构建慢性末端回肠炎的实验研究［J］.中华消化杂志，2002 ，22，(11).702-703.

［2］Miampamba M，Sharkey KA. Temporal distribution of neuronal and inducible nitric oxide synthase and nitrotyrosine during colitis in rats［J］. Neurogastroenterol Motil，1999，11(3):193-206.

［3］Wu TF，Carati CJ，Macnaughton WK ，et al. Contractile activity of lymphatic vessels is altered in the TNBS model of guinea pig ileitis［J］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2006，291(4):G566-574.

［4］周国华，主编.末端回肠炎的基础与临床［M］.北京:人民军医出版社，2008.60-96.

［5］Beck PL，Xavier R，Wong J，et al. Paradoxical roles of different nitric oxide synthase isoforms in colonic injury［J］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2004，286(1):G137-147.

［6］麦海妍.溃疡性结肠炎血清一氧化氮浓度变化的观察［J］.中国肛肠病杂志，2001，21(7):8.

［7］Dou W，Zhang J，Sun A，et al. Protective effect of naringenin against experimental colitis via suppression of Toll-like receptor 4/NFκB signalling［J］. Br J Nutr，2013 ，110(4):599-608.

［8］Kim KO，Jang BI.Emerging drugs in the treatment of inflammatory bowel disease:beyond anti-TNF-α.［J］. Korean J Gastroenterol，2011，58(5):235-244.

［9］Martín-de-Carpi J，Pociello N，Varea V. Long-term efficacy of adalimumab in paediatric Crohn's disease patients naïve to other anti-TNF therapies［J］. J Crohns Colitis，2010，4(5):594-598.

［10］Fratila OC，Craciun C. Ultrastructural evidence of mucosal healing after infliximab in patients with ulcerative colitis［J］. J Gastrointestin Liver Dis，2010 ，19(2):147-153.