DFOG抑制卵巢癌A2780细胞系球形成细胞自我更新与活化FoxO3a相关

宁映霞，邓宇傲，曹建国

(1. 广州医科大学附属第一医院，广东 广州 510120;2. 深圳市人民医院，广东 深圳 518020;3. 湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410013)

卵巢癌上皮癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是最致命的妇科恶性肿瘤之一。鉴于EOC 临床症状不典型，所以，约70%患者在确诊时已处于晚期(Ⅲ、Ⅳ期)，5年生存率约15% ～30%［1］。肿瘤细胞减灭术和化疗等初期治疗有效［2］，但80% ～85%的病例会出现耐药及复发。因此，寻找治疗卵巢癌的候选药物，具有十分重要的临床治疗学意义。

新近研究表明饮食源性黄酮类化合物，如姜黄素［3］、槲皮素［4］、金雀异黄素［5］等具有抑制肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)自我更新能力作用。在本文的研究中，我们集中研究新型金雀异黄素类似物即7-二氟甲氧基-5，4'-二正辛烷基金雀异黄素(DFOG)是如何抑制人卵巢癌A2780 细胞系球形成细胞自我更新。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

DFOG(分子量:544，性状:黄色粉末，纯度:98%)参照文献［6］方法制备;DMSO(上海安玛西亚公司)。MTT(美国sigma 公司)。鼠抗人CD133、CD44、FoxO3a、β-actin 单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记兔抗鼠二抗(美国Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.2 细胞培养和试剂

人卵巢癌细胞系A2780 购自中国科学院细胞库(中国上海市)。细胞在添加10% 胎牛血清(FBS)、100 IU/mL 青霉素G 和100 μg/mL 链霉素的高糖DMEM 中，置37 ℃、饱和湿度的5% CO2培养箱中单层贴壁生长。

成球培养:收集细胞、洗涤、去血清。然后，将收集的细胞悬浮培养在添加100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、20 ng/mL 人重组表皮生长因子(hrEGF)、10 ng/mL 人重组碱性成纤维细胞生长因子(hrbFGF)、2%不含维生素A 的B27 以及1% N2添加物(美国Invitrogen 公司)的无血清DMEM/F12培养基中。细胞以1000 细胞/孔的密度接种于超低粘附6 孔板(美国Corning 公司)。每周2 次更换培养基或添加2 次生长因子。

体外连续成球培养:温和离心收集细胞，并将细胞分散成单细胞悬液，然后悬浮培养，使其再生成新肿瘤球。第三代肿瘤球形成细胞被用于后续试验。

为了研究单细胞再次形成新肿瘤球的百分率，细胞以1000 细胞/孔的密度接种到6 孔板上以获得新肿瘤球。培养8 天后，计数肿瘤球总数。肿瘤球形成率以下列公式计算:肿瘤球总数/接种总活细胞数×100%。

1.3 MTT 测定

按照先前文献［7］的方法，将源自A2780 细胞系球形成细胞和亲本细胞以5000 个细胞每孔的密度接种在预先包被基质胶的96 孔板中。细胞暴露在浓度逐渐增加的DFOG 中。48 h 后，每孔按产商的说明添加MTT 试剂。在570nm 波长下测吸光度。

1.4 Western blot 分析

按先前文献［7］描述的方法完成Western blot 分析。细胞通过4℃条件下在裂解液中孵育20 min 裂解。Bio-Rad 含量测定系统测定蛋白浓度。总蛋白用SDS-PAGE 分离，并转移到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上。抗FoxO3a、抗CD133、抗CD44、抗β-actin 抗体被用作一抗。使用ECL 高级蛋白印记分析系统检测信号。

1.5 统计学分析

使用SPSS15.0 软件统计分析和处理数据。数据表示为均数±标准差。使用单因素方差分析进行多组均数比较，使用LSD 分析进行两两比较。适当的时候使用双侧t 检验。P ＜0.05 表示差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 A2780 细胞系球形成能力测定

我们用干细胞条件培养基悬浮培养A2780 卵巢癌细胞系细胞8 天，得到由50 ～100 细胞构成的肿瘤球(图1)。在A2780 细胞系第三代球形成细胞中，39.4%单个细胞形成新肿瘤球。此外，肿瘤球形成细胞能够在体外连续传代12 次以上。这些结果说明:A2780 细胞系SFCs 具有自我更新特性。

图1 人卵巢上皮癌A2780 细胞系肿瘤球形成

2.2 A2780 细胞系SFCs 干细胞标志物表达分析

为了进一步鉴定A2780 细胞系球形成细胞(SFCs)是否具有干细胞特性，我们用蛋白印迹法对比检测SFCs 与亲本细胞干细胞标志物表达。从图2 可见:CD133、CD44 蛋白表达水平在A2780 细胞系SFCs 中增高。

图2 人卵巢癌A2780 细胞系球形成细胞与亲本细胞CD133 和CD44 蛋白表达的比较

2.3 DFOG 对A2780 细胞系球形成细胞增殖的影响

不同剂量的DFOG(0.0 ～10.0 μM)处理A2780细胞系第3 代球形成细胞或亲本细胞48 小时，MTT比色测定结果证实:DFOG 呈浓度依赖性优先抑制SFCs 的细胞增殖活性(图3);其对SFCs 和亲本细胞的IC50值分别为0.47 μmol/L 和10.9 μmol/L。

2.4 DFOG 对A2780 细胞系球形成细胞自我更新的影响

金雀异黄素(10.0 μM)和DFOG(0.1，1.0，10.0 μmol/L)作用48h 显著降低A2780 细胞系SFCs 肿瘤球形成率，呈浓度依赖性(图4)。这些数据显示DFOG 能有效抑制A2780 细胞系SFCs 自我更新能力。

图3 DFOG 对人卵巢癌A2780 细胞系球形成细胞与亲本细胞增殖的影响

图4 DFOG 对人卵巢癌A2780 细胞系球形成细胞自我更新能力的影响

2.5 DFOG 降低FoxO3a 磷酸化水平

Western Blot 结果显示:A2780 细胞系SFCs 具有更高的FoxO3a 磷酸化蛋白表达水平，提示存在FoxO3a 的失活(图5);特别值得注意的是:DFOG能有效降低SFCs 磷酸化FoxO3a 蛋白水平和干细胞标志物CD133 和CD44 蛋白表达(图6)。

图5 卵巢癌A2780 细胞系球形成细胞与亲本细胞FoxO3a 磷酸化水平的比较

图6 DFOG 降低卵巢癌A2780 细胞系球形成细胞FoxO3a磷酸化水平和下调CD133 与CD44蛋白表达

3 讨论

肿瘤干细胞是肿瘤发生、发展、复发、转移和耐药的根源。卵巢上皮癌对目前的化疗缺乏敏感性，因此，寻求针对卵巢癌干细胞(ovarian cancer stem cells，OCSCs)的靶向治疗药物，对克服临床上现有治疗手段的缺陷，改善卵巢癌患者的预后有重要意义。

大量研究证据表明饮食来源黄酮类化合物是靶向CSCs 有前途的化学预防药物，如金雀异黄素［3-5］。因此，本文检测新型金雀异黄素类似物DFOG 是否能抑制OCSCs 自我更新作用。通过干细胞条件培养基悬浮培养法，我们得到A2780 细胞系SFCs;证实 SFCs 高表达肿瘤干细胞标志物CD133+、CD44+;并且在体外具有自我更新能力。这些结果说明A2780 细胞系SFCs 具有卵巢癌干细胞样细胞特性。特别重要的是:我们的实验结果证实:DFOG 具有抑制源自A2780 细胞的卵巢癌干细胞样细胞增殖活性和自我更新能力作用。这些研究结果为DFOG 靶向治疗卵巢癌的临床前和临床评价提供了具有说服力的实验和理论依据。

Sunayama 等人的研究显示:FoxO3a 是整合神经胶质瘤干细胞样细胞信号传导的关键转录因子;并且被认为其作为治疗胶质母细胞瘤的潜在靶点［8］。在本文的研究中，我们发现DFOG 抑制A2780 细胞系SFCs 增殖活性和自我更新能力，同时，伴随着FoxO3a 蛋白磷酸化水平和干细胞标志物CD133 与CD44 蛋白表达水平的降低;从而提示DFOG 可能通过活化FoxO3a 转录因子，进而抑制A2780 细胞系SFCs 自我更新和干细胞标志物表达。总之，我们的研究证实:DFOG 具有抑制人卵巢癌A2780 细胞系肿瘤干细胞样细胞增殖和自我更新作用。此外，活化FoxO3a 可能是这些作用的机制之一。

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