胃癌组织中PIM—3的异常表达及临床意义

刘彩霞++康世荣

[摘要] 目的 研究并分析胃癌组织中PIM-3的异常表达及其临床意义。 方法 选择2013年6月～2014年2月于内蒙古医科大学附属医院行胃癌组织根治性切除的患者50例为研究对象，采用免疫组织化学法（SP法）分别测定PIM-3在50例胃癌组织和及其中25例患者的癌旁组织中的表达，分析PIM-3与性别、年龄、肿瘤大小等有关参数的相关性。 结果 癌旁组织中PIM-3的表达阳性率（16%）显著低于胃癌组织（90%）；PIM-3的表达与胃癌组织中分化程度、浸润程度、淋巴转移和静脉转移密切相关（P < 0.05），而与性别、年龄、肿瘤直径关系不大（P > 0.05）。 结论 PIM-3参与胃癌组织细胞的分化、浸润和转移，促进肿瘤恶化和癌症发展。

[关键词] 胃癌组织；PIM-3；异常表达

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）11（c）-0025-04

The abnormal expression and clinical significance of PIM-3 in gastric cancer tissue

LIU Caixia1 KANG Shirong2

1.Department of Tumor， the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Inner Mongolia Autonomous Region， Huhhot 010059， China； 2.Department of Chest， the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Inner Mongolia Autonomous Region， Huhhot 010059， China

[Abstract] Objective To research research and analyze the abnormal expression and clinical significance of PIM-3 in gastric cancer tissue. Methods 50 cases of patients with gastric cancer from June 2013 to February 2014 in the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University were selected as study objects. The expression of PIM-3 in the gastric cancer patients and 25 cases of normal tissues adjacent to the 50 cases of gastric cancer tissues pIM - 3 were detected by immunohistochemical method （SP method）， the correlation between PIM-3 and related parameters such as sex， age， tumor size were analyzed（SP）. Results The PIM-3 expression in normal tissue were 16%， which was significantly lower than that of gastric cancer tissues （90%）. The expression of PIM-3 in gastric cancer tissue was closely related to the differentiation degree， infiltration degree， lymph node metastasis and venous metastasis （P < 0.05）， and had no correlation with sex， age and diameter of tumor （P > 0.05）. Conclusion The PIM-3 plays a role in the tumor in differentiation， invasion and metastasis of gastric cancer tissues and cells， and promotes the development of tumor progression and cancer.

[Key words] Gastric cancer tissue； PIM-3； Abnormal expression

胃肠道癌是最常见和最主要的恶性肿瘤，严重威胁人类健康。而胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，占我国消化道肿瘤的第1位，故研究胃癌的发病机制和解决办法对世界而言有着举足轻重的意义。由于胃癌发病因素多样，且具有明显的地域性，其预后与病理分期、部位、组织类型、生物学行为以及治疗措施密切相关，为了提出针对全人类的胃癌治疗方案，着重于基因的研究是最佳选择。胃癌的发展是在多种因素的作用下发展而成的，正常情况下，胃黏膜细胞的增殖与凋亡保持动态平衡，该平衡是有赖于抑癌基因和癌基因的共同调节下的平衡，一旦平衡被打破，胃黏膜上皮细胞过度增殖，则可能逐渐发展为胃癌，尤其是近年来发现的幽门螺旋杆菌特别是高毒性的幽门螺旋杆菌导致的胃黏膜损伤，由慢性胃炎、肠上皮化生、不典型增生到典型胃癌。据研究，PIM激酶是一个与哺乳动物蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶密切相关的家族，其能使促凋亡分子Bad发生磷酸化而失活，同时使抗凋亡家族Bcl-XL、Bcl-2的表达增加，导致细胞恶性增殖[1-2]。PIM家族有3个成员，PIM-1、PIM-2和PIM-3，目前PIM-3在肿瘤发生中的研究主要集中在尤文肉瘤、肝癌、胰腺癌、结肠癌及胃癌等[3-5]。本研究通过免疫组织化学SP法，分别测定PIM-3在50例胃癌组织和25例癌旁组织标本中的表达，分析其与有关临床病理参数的相关性。为今后胃癌的临床治疗开辟新思路。现将分析方法和结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013年6月～2014年2月于内蒙古医科大学附属医院（以下简称“我院”）行胃癌组织根治性切除的手术患者50例为研究对象，其中低分化胃癌25例，年龄38～72岁，平均（54.2±14.1）岁，男16例，女9例；高-中分化患者25例，年龄42～70岁，平均（52.8±15.1）岁，男15例，女10例。排除曾经接受放疗或者化疗等方面治疗的患者。随机在50例胃癌组织周围采集25例患者的癌旁组织，其中男15例，女10例。癌旁常组织取自患者癌组织范围2.5 cm以外的区域，经切片病理染色分析证实均无癌变细胞，患者的个人基本资料和肿瘤相关参数来源于我院病案室。本研究经我院伦理委员会通过，患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

主要试剂为羊抗人PIM-3多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）， 浓度为1∶200。①制作切片：包埋组织每份制作切片1和切片2，每片厚度约4 μm。②切片1处理：常规脱蜡至水后缓冲液冲洗3 min×2 次，Hydrogen Peroxide Block中孵育12 min，缓冲液洗5 min×2次，Ultra V Block背景染色，缓冲液洗5 min×2 次，滴加一抗工作液 37℃孵育1.5 h，缓冲液洗5 min×2次，Primary Antibody Enhancer室温下孵育20 min，缓冲液洗5 min×2次，加辣根过氧化物酶聚合物室温下孵育30 min，缓冲液洗5 min×2次，1 mL 二氨基联苯胺（DAB）Plus Substrate中滴加 1～2滴DAB Plus Chromogen混匀后滴加到切片上，孵育10 min，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。③切片2处理：石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2室温孵育5 min，蒸馏水冲洗，磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡5 min×2次，5%～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10 min，倾去血清，滴加一抗工作液，4℃过夜；PBS冲洗，5 min×3 次；生物素标记二抗工作液，37℃孵育15 min；PBS 冲洗，5 min×3 次；滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min；PBS冲洗，5 min ×3次；DAB显色剂显色3～15 min；自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。④镜检：每张切片选取具有代表性的5个高倍视野，计数1000个细胞中的阳性细胞数。所有标本的组织病理学诊断均由两名病理学专家采用盲法独立检测取平均值，高倍镜下随机观察至少4个视野复核证实。

1.3 镜检结果评定标准

阳性细胞判断标准[6]：PIM-3阳性定位于细胞质，细胞质染成棕黄色为阳性细胞。依据《全国免疫组织化学技术及诊断标准化专题研讨会》标准[7]，按阳性细胞所占比例进行分级：<25%为阴性（-），25%～50%为弱阳性（+），>50%～75%为阳性（++），>75%为强阳性（+++）。以弱阳性、阳性、强阳性来统计阴性率。

1.4 观察指标

测定PIM-3在50例胃癌组织和及其中25例患者的癌旁组织中的表达，分析PIM-3与性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、浸润程度、淋巴转移、静脉转移的相关性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用秩和检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织和癌旁组织标本中PIM-3的表达

根据镜检结果评定标准，两组标本的镜检结果显示：胃癌组织中PIM-3阳性率远高于癌旁组织，差异有高度统计学意义（Z=5.847，P = 0.000）。见表1。

表1 胃癌组织和癌旁组织标本中PIM-3的表达（例）

3 讨论

胃癌的发病率和病死率在世界范围内居第2位，具有发病率高达30/10万～70/10万，复发转移率高达50%，病死率高达30/10万的特点，同时早诊率低于10%，根治切除率低于50%，5年生存率≤50%[8]。所以，早发现、早诊断、早治疗显得尤为重要，但是目前还没有发现胃癌的特异性标志物，这一难题的解决显得十分迫切。随着分子生物学进展，原癌基因的研究逐渐深入，原癌基因PIM-1、PIM-2均属PIM家族的成员，PIM家族激酶能使在细胞生长通路中起关键作用的蛋白质分子残基磷酸化，促进细胞增殖和生存，PIM-3引起恶性肿瘤发生的机制主要是使促凋亡分子Bad发生磷酸化而失活，同时使抗凋亡家族Bcl-2的表达增加，从而导致肿瘤细胞的失控生长，Bad的促凋亡活性由其蛋白质分子内的残基磷酸化来调控的，非磷酸化的Bad可以结合Bcl-X也可以包括Bcl-2并使两者失活，通过与14-3-3蛋白分离，从线粒体易位到胞浆，从而丧失了与Bcl-X、Bcl-2结合的能力，从Bad游离出来后的Bcl-X、Bcl-2则保持了线粒体膜的潜能，能阻止细胞凋亡[10-15]。PIM-3最初以大鼠细胞系PC12去极化诱导的基因首先报道，它在哺乳动物细胞中与PIM-1的序列具有同源性，在功能上与前二者相似，有学者发现PIM-3 mRNA在人的心脏、骨骼肌、大脑、脾脏、肾脏中存在，在心肌和骨骼肌中呈高表达，相反，在结肠、胸腺、肝脏等组织中不表达，还证实了PIM-3蛋白在人肝细胞的癌旁组织，一部分癌组织及再生的胆管细胞中表达，且在癌旁组织中的表达较癌组织中高[16-18]。从人类开始研究肿瘤开始，逐渐发现癌基因的异常激活和抑癌基因失活，以及环境、生活方式、情绪等多种因素都对癌症的发生都有影响。从1997年人们发现PIM基因来，对该基因的研究逐渐深入。研究人员已发现PIM激酶家族能使促凋亡分子Bad发生磷酸化而失活，同时使抗凋亡家族Bcl-XL、Bcl-2的表达增加，从而导致肿瘤细胞的失控生长[19-21]。

本研究通过测定PIM-3在50例胃癌组织和25例胃癌癌旁组织标本中的表达，分析其与有关临床病理参数的相关性发现：癌旁组织中PIM-3的表达阳性率为16%，显著低于胃癌组织（90%），与Zheng等[22]的研究结果一致，表明PIM-3在胃癌发生机制中有着重要的决定性作用；PIM-3的表达与胃癌组织中分化程度、浸润程度、淋巴转移和静脉转移密切相关（P < 0.05），而与性别、年龄、肿瘤直径关系不大（P > 0.05），这与胡志方等[6]的研究结果一致，说明PIM-3与胃癌的生物学行为有一定相关性，其参与胃癌组织细胞的分化、浸润和转移，促进肿瘤恶化和癌症发展。

综上所述，癌旁组织中不表达PIM-3，但在癌组织里的表达明显增高。PIM-3在癌组织中的高表达可能是胃癌某一阶段的标志物，也可能是胃癌启动的一个环节，也可能是影响预后的重要因素。因此本研究认为，PIM-3是一种较为理想的胃癌标志物，而在分化较高的胃癌组织中，其表达明显高于分化程度低的胃癌组织，从PIM-3蛋白和一些病理资料的相关性分析结果来看，PIM-3蛋白的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、浸润程度无明显相关性，而与肿瘤的淋巴结转移、静脉转移有明显相关性，说明PIM-3与胃癌的生物学行为有一定的相关性，其表达是反映胃癌生物学进展程度和肿瘤预后的标志。由于条件所限，未能与胃腺瘤等良性疾病进行对照研究，还需要进一步扩大样本含量，并对胃黏膜异型增生、胃腺瘤进行对照研究，更需要长期随访结合分期来明确PIM-3基因与生存的关系，从而带来更多的诊治思路及思考。

[参考文献]

[1] 简捷.直肠腺癌中原癌基因Pim-3及其蛋白表达的研究[D].南昌：南昌大学，2009.

[2] Fox CJ，Hammerman PS，Thompson CB. The Pim kinases control rapamycin-resistant T cell survival and activation [J]. J Exp Med，2005，201（8）：2590-2660.

[3] Manning G，Whyte DB，Martinez R，et al. The protein kinase complement of the human genome [J]. Science，2002，298（5）：1912-1934.

[4] 李小燕，朱水山，刘亮明，等.Pim-3基因的分子生物学特性及作用[J].医学分子生物学杂志，2008，24（2）：524-526.

[5] Popivanova BK，Li YY，Zheng H，et al. Proto-oncogene，PIM-3 with serine/threonine kinase activity， is aberrantly expressed in human colon cancer cells and can prevent Bad-mediated apoptosis [J]. Cancer Sci，2007，98（1）：321-328.

[6] 胡志方，黄缘，钟琼，等.Pim-3异常表达在胃癌中的意义[J].世界华人消化杂志，2008，16（31）：3515-3518.

[7] 中华病理学杂志编辑委员会.全国免疫组织化学技术与诊断标准化专题研讨会会议纪要[J].中华病理学杂志，1996， 25（6）：326.

[8] 邹小农，陈万青，张思维，等.中国部分市县1998-2002胃癌发病与死亡[J].中国肿瘤，2007，16（3）：142-145.

[9] 娄清涛，全培良，陆建邦，等.河南省胃癌病死率地理分布的趋势面分析[J].郑州大学学报：医学版，2010，45（5）： 726-728.

[10] 任丛林，王瑞平.基于压缩感知算法的基因表达谱数据分析[J].北京生物医学工程，2013，32（2）：195-197，200.

[11] Li YY，Mukaida N. Pathophysiological roles of Pim-3 kinase in pancreatic cancer development and progression [J]. World J Gastroenterol，2014，20（28）：9392-9404.

[12] Guo Q，Lan P，Yu X，et al. Immunotherapy for hepatoma using a dual-function vector with both immunostimulatory and Pim-3-silencing effects [J]. Mol Cancer Ther，2014，13（6）：1503-1513.

[13] Wang J，Lao L，Zhao H，et al. Serine threonine kinase Pim-3 regulates STAT3 pathway to inhibit proliferation of human liver cancers [J]. Int J Clin Exp Med，2014，7（2）：348-355.

[14] Lou L，Wang Y，Cui J，et al. Differential expression of Pim-3，c-Myc，and p-p27 proteins in adenocarcinomas of the gastric cardia and distal stomach [J]. Tumour Biol，2014， 35（5）：5029-5036.

[15] Zhang F，Liu B，Wang Z，et al. A novel regulatory mechanism of Pim-3 kinase stability and its involvement in pancreatic cancer progression [J]. Mol Cancer Res，2013，11（12）：1508-1520.

[16] Wang C，Li HY，Liu B，et al. Pim-3 promotes the growth of human pancreatic cancer in the orthotopic nude mouse model through vascular endothelium growth factor [J]. J Surg Res，2013，185（2）：595-604.

[17] Xu D，Cobb MG，Gavilano L，et al. Inhibition of oncogenic Pim-3 kinase modulates transformed growth and chemosensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine [J]. Cancer Biol Ther，2013，14（6）：492-501.

[18] Wang Z，Li XM，Shang K，et al. T-18，a stemonamide synthetic intermediate inhibits Pim kinase activity and induces cell apoptosis，acting as a potent anticancer drug [J]. Oncol Rep，2013，29（3）：1245-1251.

[19] Liu LM，Sun SL，Ye CG，et al. Inhibitive mechanisms of Pim-3 affecting fulminant hepatic apoptosis [J]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2012，20（9）：688-692.

[20] Narlik-Grassow M，Blanco-Aparicio C，Cecilia Y，et al. The essential role of PIM kinases in sarcoma growth and bone invasion [J]. Carcinogenesis，2012，33（8）：1479-1486.

[21] 邵雪辉，王建国，张晓丽，等.红外线对萎缩性胃炎大鼠PCNA及Bcl-2表达的影响[J].北京生物医学工程，2012， 31（1）：87-89.

[22] Zheng HC，Tsuneyama K，Takahashi H，et al. Aberrant Pim-3 expressionis involved in gastric adenoma-adenocarcinomasequence and cancer progression [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2008，134（1）：481-488.

（收稿日期：2014-07-28 本文编辑：任 念）

[16] Wang C，Li HY，Liu B，et al. Pim-3 promotes the growth of human pancreatic cancer in the orthotopic nude mouse model through vascular endothelium growth factor [J]. J Surg Res，2013，185（2）：595-604.

[17] Xu D，Cobb MG，Gavilano L，et al. Inhibition of oncogenic Pim-3 kinase modulates transformed growth and chemosensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine [J]. Cancer Biol Ther，2013，14（6）：492-501.

[18] Wang Z，Li XM，Shang K，et al. T-18，a stemonamide synthetic intermediate inhibits Pim kinase activity and induces cell apoptosis，acting as a potent anticancer drug [J]. Oncol Rep，2013，29（3）：1245-1251.

[19] Liu LM，Sun SL，Ye CG，et al. Inhibitive mechanisms of Pim-3 affecting fulminant hepatic apoptosis [J]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2012，20（9）：688-692.

[20] Narlik-Grassow M，Blanco-Aparicio C，Cecilia Y，et al. The essential role of PIM kinases in sarcoma growth and bone invasion [J]. Carcinogenesis，2012，33（8）：1479-1486.

[21] 邵雪辉，王建国，张晓丽，等.红外线对萎缩性胃炎大鼠PCNA及Bcl-2表达的影响[J].北京生物医学工程，2012， 31（1）：87-89.

[22] Zheng HC，Tsuneyama K，Takahashi H，et al. Aberrant Pim-3 expressionis involved in gastric adenoma-adenocarcinomasequence and cancer progression [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2008，134（1）：481-488.

（收稿日期：2014-07-28 本文编辑：任 念）

[16] Wang C，Li HY，Liu B，et al. Pim-3 promotes the growth of human pancreatic cancer in the orthotopic nude mouse model through vascular endothelium growth factor [J]. J Surg Res，2013，185（2）：595-604.

[17] Xu D，Cobb MG，Gavilano L，et al. Inhibition of oncogenic Pim-3 kinase modulates transformed growth and chemosensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine [J]. Cancer Biol Ther，2013，14（6）：492-501.

[18] Wang Z，Li XM，Shang K，et al. T-18，a stemonamide synthetic intermediate inhibits Pim kinase activity and induces cell apoptosis，acting as a potent anticancer drug [J]. Oncol Rep，2013，29（3）：1245-1251.

[19] Liu LM，Sun SL，Ye CG，et al. Inhibitive mechanisms of Pim-3 affecting fulminant hepatic apoptosis [J]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2012，20（9）：688-692.

[20] Narlik-Grassow M，Blanco-Aparicio C，Cecilia Y，et al. The essential role of PIM kinases in sarcoma growth and bone invasion [J]. Carcinogenesis，2012，33（8）：1479-1486.

[21] 邵雪辉，王建国，张晓丽，等.红外线对萎缩性胃炎大鼠PCNA及Bcl-2表达的影响[J].北京生物医学工程，2012， 31（1）：87-89.

[22] Zheng HC，Tsuneyama K，Takahashi H，et al. Aberrant Pim-3 expressionis involved in gastric adenoma-adenocarcinomasequence and cancer progression [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2008，134（1）：481-488.

（收稿日期：2014-07-28 本文编辑：任 念）