鞘氨醇单胞菌的3-苯氧基苯甲酸降解酶定位及分子质量确定*

李建龙，王志龙，刘书亮，姚开，邓维琴，黄道梅，赖海梅

1(四川农业大学食品学院，四川 雅安，625014)

2(四川大学轻纺与食品学院，四川成都，610065)

拟除虫菊酯类农药具有高效、低毒、选择性好等优点，已在全世界范围内被广泛使用。该类农药对光、热具有稳定性，自然条件下难迅速降解［1-2］，长期接触有致畸、致癌、致突变的危险［3-4］。3-PBA是大多数拟除虫菊酯类农药的分解产物之一［5-6］，与拟除虫菊酯类农药相比，在环境中的迁移速率更快，在土壤中的半衰期长达180 d左右［7］，远远长于大多数拟除虫菊酯杀虫剂约30 d的半衰期。3-PBA对微生物的生长具有一定的抑制作用，能阻止拟除虫菊酯类农药的彻底降解，从而使得该类农药难以被生物降解为无毒小分子［8］，因此3-PBA对生态环境和人类健康的潜在危害性较菊酯类杀虫剂大［9］。微生物降解效率高、无二次污染，且可有效降低环境中的有毒污染物［10］，但其降解效率可能低于其降解酶［11］，且菌株产生的降解酶对环境条件的忍受范围比菌体宽［12］，酶又是一类蛋白质，安全性比微生物更高［13］。Chen等分离到多株可降解3-PBA的菌株，如Ochrobactrum lupini［14］、Streptomyces aureus［15］、Bacillus sp.［16］、Stenotrophomonas sp.［17］，并研究了降解菌株的降解特性及降解途径等，但未进行3-PBA降解酶研究;许育新等［18］分离到1 株Pseudomonas sp.PBM11 菌株，24h可完全降解200 mg/L的3-PBA，并提取PBM11菌株的质粒，推断3-PBA降解酶基因可能位于质粒上;邱吉国等［19］分离到1株可降解乙羧氟草醚的菌株(Pseudomonas sp.)，乙羧氟草醚和3-苯氧基苯甲酸都含有二苯醚键结构，实验中检测到菌株细胞内邻苯二酚1，2-双加氧酶对乙羧氟草醚有活性，推断乙羧氟草醚降解途径是先醚键断裂然后脱去苯环上的侧链，最终通过邻苯二酚1，2-双加氧酶裂解开环。

本文针对1株可高效降解3-PBA的鞘氨醇单胞菌SC-1(在MM培养基中，30℃，16 h可将300 μg/mL 3-PBA完全降解)，研究其产3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)降解酶的细胞定位，并对该降解酶进行Native-PAGE和SDS-PAGE电泳，初步确定酶的分子质量，为深入研究3-PBA降解酶提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)SC-1，由四川农业大学食品微生物实验室分离保藏，可高效降解3-PBA(在MM培养基中，30℃，16 h可将300 μg/mL 3-PBA完全降解)。

1.1.2 培养基

LB固体培养基:酵母膏5 g;蛋白胨10 g;NaCl 10 g;琼脂2 g;水1 000 mL;调pH值至7.0;加入3-PBA至终浓度 100 μg/mL。

LB液体培养基作为发酵种子培养基。

MM培养基:(NH4)2SO41.5 g;MgSO40.2 g;NaCl 0.5 g;KH2PO40.5 g;K2HPO41.5 g;蒸馏水1 000 mL;pH 7.5，3-PBA 浓度为 100 μg/mL。

发酵培养基:(NH4)2SO41.5 g;MgSO40.5 g;NaCl 0.5 g;KH2PO40.5g;K2HPO41.5 g;葡萄糖5.0 g;酵母浸出粉5.0 g;水1 000 mL;调节pH值至7.0;加入3-PBA 至 100 μg/mL。

以上培养基均121℃灭菌15 min。

1.1.3 药品及试剂

3-苯氧基苯甲酸(98%)，Sigma公司;检测用乙腈(色谱纯)，德国CNW Technologies GmbH公司;丙烯酰胺，成都溶海公司;甲叉双丙烯酰胺，Sigma公司;SDS，美国Amresco公司;TEMED(进口分装);过硫酸铵，上海诺伦生物医药技术有限公司;考马斯亮蓝R-250，天根生化科技(北京)有限公司;蛋白质分子质量标准(低)，天根生化科技(北京)有限公司;溴酚蓝，天津市巴斯夫化工有限公司。

PBS缓冲液:用 KH2PO4及 K2HPO4配制 0.02 mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液。

PBS底物缓冲液:将3-PBA充分溶于0.02 mol/L、pH 7.0的PBS缓冲溶液中，分别制成5 μg/mL及20 μg/mL的PBS底物缓冲溶液。

其他化学试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.4 主要仪器设备

UV-3200紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司;RZ-10L发酵罐，南京瑞泽生物工程设备有限公司;LC-10A2010C HT型液相色谱仪(配有可变波长紫外检测器，LC-solution工作站)，日本Shimazu公司;Gel Doc XR凝胶成像仪，BIO-RAD公司;Milli-Q Gradient超纯水系统，Millipore公司;Scientz-ⅡD超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司;DSHZ-300水浴恒温多用途摇床培养箱，江苏太仓市实验设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 3-PBA降解酶的细胞定位

1.2.1.1 发酵液的制备

从平板上挑取SC-1单菌落，划线于LB斜面培养基上，30℃恒温培养24 h。用无菌生理盐水将SC-1菌苔从斜面培养基上洗脱并混匀制成菌悬液，接种1.0 mL SC-1菌悬液(菌浓度约为108CFU/mL)于30 mL发酵培养基中，30℃，180 r/min恒温摇振培养24 h得种子液，将种子液按3%接种至发酵罐，发酵罐装料系数0.65，接种量6.25%，起始pH 7.0，发酵温度30℃，转速控制在300 r/min，发酵罐压维持在0.04～0.05 MPa，产泡较多时加少量无菌消泡油进行消泡。发酵培养24 h，得到SC-1发酵混合液。

发酵结束后将SC-1发酵混合液冷冻离心(4℃，10 000 r/min，10 min)，离心分别收集上清液及菌体沉淀，菌体沉淀用0.02 mol/L PBS缓冲液悬浮清洗2次后于-20℃低温保存备用。

1.2.1.2 3-PBA降解酶初步定位

胞外酶液:在冰水浴下，向500 mL的SC-1发酵上清液中缓慢加入烘干研细的(NH4)2SO4粉末，并同时利用磁力搅拌器进行搅匀，使(NH4)2SO4饱和度逐渐达到100%，4℃盐析过夜。低温冷冻离心(4℃，10 000 r/min，10 min)收集盐析液中蛋白沉淀，用0.02 mol/L PBS缓冲液溶解蛋白沉淀，并于4℃条件下透析(透析袋截留系数MWCO=14 000)直至氯化钡溶液检测透析液中无SO42-，4 ℃条件下用聚乙二醇20000浓缩酶液至1 mL。

胞内粗酶液和菌体细胞碎片液:将SC-1菌体室温解冻，称取1.0 g湿菌体，按1 g菌体+4 mL PBS缓冲液的比例重悬，冰浴中超声破碎(功率290 W，工作1 s，间歇3 s)菌悬液1 200 s，4 ℃10 000 r/min离心10 min，上清液为SC-1胞内粗酶液。沉淀用PBS缓冲液重悬离心清洗2次，再向沉淀中加入4 mL PBS缓冲液重悬，即细胞碎片液。

降解酶活力测定:取0.5 mL的20 μg/mL PBS底物缓冲液与0.4 mL PBS缓冲溶液混匀，30℃保温10 min后加入粗酶液0.1 mL，水浴摇振反应10 min，1 mL乙腈终止反应。以加入酶液后立即用乙腈终止反应的样品为空白对照，HPLC检测反应体系中3-PBA残留量。

1.2.1.3 3-PBA 的检测方法［8］

样品处理:色谱纯乙腈终止体系反应并定容至10 mL，混匀后10 000 r/min离心10 min，取上清液过有机相滤膜，弃去初滤液，取续滤液用于 HPLC检测［8］。

HPLC检测条件:色谱柱:Gemini 100Å C18柱(5.0 μm，150 mm ×4.60 mm，i.d.)，流动相为 V(乙腈)∶V(磷酸水)=55∶45，磷酸水 pH=2.5，流速为0.7 mL/min，进样量为10 μL，检测波长为210 nm，柱温 25 ℃［8］。

3-苯氧基苯甲酸降解酶的酶活力定义:在本实验条件下，1.0 min内使3-PBA减少1.0 nmol所需要的酶量为1个酶活力单位(U)。

3-PBA残留量(μg/mL)计算:

式中:Cx，3-PBA残留量;C0，样品中3-PBA初始浓度;Sx，样品中残留3-PBA的峰面积;S0，样品中初始3-PBA的峰面积。

1.2.1.4 细胞膜片段的分离

将重悬后的细胞碎片液于冰水浴中超声破碎(功率290 W，工作1 s，间歇3 s)1 200 s。向10 mL透明离心管中加入1 mL 37%蔗糖溶液，再用注射器缓慢向37%蔗糖溶液底部注入3 mL 41%蔗糖溶液，使之形成清晰的蔗糖梯度浓度界面。取0.4 mL破碎细胞碎片液沿管壁缓慢旋转加入至蔗糖溶液表面，4℃离心(12 000 r/min，20 min)，收集蔗糖梯度界面层雾状细胞膜［20］。4℃透析除去雾状细胞膜中的高浓度蔗糖溶液，4℃条件下用聚乙二醇20000浓缩至少量细胞膜悬浮液。收集蔗糖密度梯度离心的细胞碎片，用PBS缓冲液清洗离心2次，再恢复细胞碎片至蔗糖密度梯度离心前原体积。

分别向0.5 mL细胞膜浓缩液和0.1 mL细胞碎片悬液中加入0.5 mL 5 μg/mL PBS缓冲液，补足反应体系至1.0 mL，30℃水浴、摇振反应2 h后，1 mL乙腈终止反应。以加入PBS底物缓冲液后立即用乙腈终止反应的样品为空白对照，HPLC检测反应体系中3-PBA残留量。

1.2.2 3-PBA降解酶分子质量的初步确定

1.2.2.1 Native-PAGE分离膜蛋白及切胶回收作3-PBA降解反应

将密度梯度离心所得的细胞膜片段悬浮液置于冰水浴中超声破碎 (功率50 W，工作1 s，间歇3 s)2 400 s，破碎后置于透析袋(透析袋截留系数MWCO=14 000)中，于4℃用聚乙二醇20000浓缩至少量膜片段悬液。

取Native-PAGE样品缓冲液50 μL与膜片段悬液样品200 μL混合，不经离心取样品混合液直接上样。恒定电压90 V电泳至样品进入分离胶，提高电压至120 V电泳，待溴酚蓝接近胶边缘0.5 cm处，电泳结束，取一块凝胶用蛋白染色液进行染色1 h，脱色液脱色，直至出现清晰条带;另一块凝胶用Native-PAGE电泳缓冲液浸泡，4℃暂存。

凝胶配方参见《蛋白质纯化技术及应用》［21］(表1)。

取另一块Native-PAGE凝胶，比对蛋白染色后的凝胶分别对电泳条带进行切胶回收。取相同重量的聚丙烯酰胺凝胶分别研碎，加入0.5 mL 5 μg/mL PBS底物缓冲液及3.0 mL PBS缓冲液，30℃水浴摇振反应24 h，以加入蛋白染色无条带的凝胶反应体系为空白对照。色谱纯乙腈终止反应并定容至10 mL体系，HPLC检测反应体系中3-PBA残留量。

表1 Native-PAGE凝胶配方Table 1 Gel composition of Native-PAGE gel

1.2.2.2 3-PBA降解酶SDS-PAGE

切胶回收作3-PBA降解反应时，有3-PBA降解活性的蛋白条带，将此条带凝胶切成小块，完全浸没于含SDS-PAGE电泳缓冲溶液的透析袋中，于水平电泳槽上对凝胶中的蛋白进行电泳洗脱(电压200 v，洗脱时间8 h)。离心电泳洗脱液得上清液，于4℃条件下用聚乙二醇20000浓缩至少量，取SDS-PAGE样品缓冲液50 μL与浓缩后样品200 μL混合，沸水浴5 min，10，000 r/min 离心 5 min，直接取样品混合上清液上样，电泳及染色同Native-PAGE。

SDS-PAGE凝胶制备参见《蛋白质纯化技术及应用》［21］(表 2)。

表2 SDS-PAGE凝胶配方Table 2 Gel composition of SDS-PAGE gel

2 结果与分析

2.1 3-PBA降解酶的细胞定位

鞘氨醇单胞菌SC-1细胞不同部位3-PBA降解酶活性如图1所示。可以看出，活细胞菌悬液的3-PBA降解酶活性最高，胞外粗酶液、胞内粗酶液及细胞碎片粗酶液均有3-PBA降解酶活性，但3-PBA降解酶活性主要集中于细胞碎片中，胞外粗酶液及胞内粗酶液的活性较低，这可能与粗酶液制备时的菌体细胞及碎片残留于胞外、胞内粗酶液有关。

图1 菌株SC-1细胞不同部位3-PBA降解酶活性Fig.1 Activity of 3-PBA-degrading enzymes from different parts of SC-1

鞘氨醇单胞菌SC-1细胞膜降解3-PBA的HPLC色谱图如图 2 所示，1#、2#、3#、4#、5#为非目标峰(培养基杂质峰或细菌代谢产物峰)，6#为目标峰(3-PBA)，出峰时间为7.21 min。SC-1细胞碎片再次破碎并经蔗糖密度梯度离心等多步处理后，其分离得到的细胞膜对3-PBA仍有一定的降解酶活性，且有疑似降解产物苯酚的生成［8］，说明在鞘氨醇单胞菌SC-1中3-PBA降解酶位于细胞膜上。而细胞碎片悬液对3-PBA降解率高于细胞膜悬液可能是:(1)超声处理虽然能使部分细胞膜从碎片上剥离下来，但细胞碎片上仍吸附有细胞膜;(2)虽经过超声波细胞破碎，但由于未能完全破碎菌体，因此细胞碎片中仍有完整的活细胞;(3)将细胞膜剥离后其稳定性降低。

图2 鞘氨醇单胞菌SC-1细胞膜降解3-PBA的HPLC色谱图Fig.2 The chromatogram of degrading 3-PBA by the cytomembrane of Sphingomanas sp.SC-1

2.2 鞘氨醇单胞菌SC-1中3-PBA降解酶的分离

将蔗糖密度梯度离心后得到的细胞膜再次破碎浓缩，并对其进行Native-PAGE电泳后染色(图3)，针对染色后的主要条带将未染色凝胶进行切胶回收，破碎后的细胞膜电泳时出现多条蛋白条带。

图3 鞘氨醇单胞菌SC-1细胞膜Native-PAGE图Fig.3 The Native-PAGE diagram of the cytomembrane of Sphingomanas sp.SC-1

Dehmel等［22］得出蛋白质在Native-PAGE中的迁移率主要取决于它所带电荷及分子大小，因此对分离胶中疑似降解酶的条带a、b及c进行切胶回收和3-PBA降解反应。回收蛋白条带降解3-PBA的HPLC色谱图如图4所示，7#、8#、9#为非目标峰(杂质峰)，10#为目标峰(3-PBA)，出峰时间为7.21 min，条带a及条带b未检测有3-PBA降解活性，条带c在24 h内对0.5 mL、5 μg/mL 3-PBA的降解率为22.23%，仍具有一定的降解活性，见图4。

图4 回收蛋白条带降解3-PBA的HPLC色谱图Fig.4 The chromatogram of degrading 3-PBA by the protein recovered

对Native-PAGE凝胶中的条带c进行切胶回收，条带c经电泳洗脱浓缩后与细胞膜破碎液一同进行SDS-PAGE，结果见图5。条带c在SDS-PAGE上出现2条条带，其分子质量约为50～90 ku，推测鞘氨醇单胞菌SC-1中3-PBA降解酶位于细胞膜上面，其可能是一类多亚基结构酶。

3 讨论与结论

图5 回收蛋白条带SDS-PAGE图Fig.5 SDS-PAGE diagram of degrading 3-PBA by the protein recovered

(1)根据3-PBA的化学结构推测，其降解酶可能是氧化酶中的一种。Shaohua等［16］检测菌株(Bacillus sp.)降解3-PBA的产物时，发现3-(2-羟基苯氧基)苯甲酸在初期大量积累，之后经过二芳基醚键的断裂生成原儿茶酸、苯酚等，由此推断菌株可产一种3-PBA氧化酶;Halden等［23］分离到1株产碱假单胞菌POB310，虽不能完全降解3-PBA，但能通过角双加氧酶的作用使二苯醚键断裂，生成苯酚和原儿茶酸。目前报道的大部分芳香族化合物氧化酶主要为胞内酶［24］，也有部分位于细胞膜上，吴炬等［25］分离出的甲基单胞菌(Methylomonas sp.)具有较高的甲烷单加氧酶活性，且酶位于细胞膜上，可催化甲烷羟基化反应生成甲醇;在真核生物中氧化酶主要分布于光滑内质网上，也有部分位于细胞器的膜中［9］，而原核生物没有细胞器，呼吸作用由细胞膜完成，其主要酶系也都分布于细胞膜上。这与本实验得出的鞘氨醇单胞菌SC-1中3-PBA降解酶是一类膜蛋白吻合。本文首次提出了鞘氨醇单胞菌3-PBA降解酶位于细胞膜上，为3-PBA降解酶的进一步研究提供了理论基础。

(2本实验采用超声波细胞破碎仪对分离得到的细胞膜进行处理，通过超声过程中的空穴作用使细胞膜进一步破裂成碎片，使膜蛋白与细胞膜分离，通过Native-PAGE发现，膜蛋白可得到较好的分离，并具有一定的活性。

(3)本文对Native-PAGE中有降解活性的条带c回收后进行SDS-PAGE分析，得到2条蛋白条带，条带蛋白所对应分子质量均较Dehmel等［22］从基因角度预测的分子质量大，约为50～90 ku。根据降解酶分子质量可初步推测出降解酶基因的大小，对3-PBA降解酶基因的研究及基因工程菌的构建具有指导意义，段晓芹等［26］分析了菌株 Sphingobium fanise JZ-2降解3-苯氧基苯甲酸的代谢产物，其中有邻苯二酚的生成，邻苯二酚在邻苯二酚1，2-双加氧酶作用下开环，根据邻苯二酚1，2-双加氧酶基因序列设计兼并引物，成功地从JZ-2基因组扩增出邻苯二酚1，2-双加氧酶基因(catA);Zhang等［27］从菌株 Ralstonia eutropha JMP134扩增出降解3-苯氧基苯甲酸的基因mbhDHIM，最终获得了可矿化3-苯氧基苯甲酸的工程菌。

(4)本文确定了鞘胺醇单胞菌的3-苯氧基苯甲酸降解酶的产生位于细胞膜上，该酶是一种膜蛋白，分子质量约为50～90 ku。

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