大豆蛋白的可溶性水解物、可溶/不溶性聚集体对乳化香肠品质的影响*

简华君，李鹏鹏，黄小林，陈洁

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)

大豆分离蛋白(SPI)具有良好的凝胶性、乳化性、持油持水性等功能性质，因此被广泛应用于乳化香肠、火腿肠等肉制品中，以此提高产品质构和得率［1］。然而，关于添加SPI对肉制品影响的研究报道却存在不一致性。例如，Matulis等人指出添加3%的商业SPI增强了乳化香肠的硬度［2］;Pietrasik等人发现2%的商业SPI提高了肉凝胶强度［3］;Chin等人发现，添加2.2%商业SPI不影响乳化香肠的凝胶强度，但添加量为4.4%时削弱了香肠质构［1］;然而，Foegeding等人认为，大豆蛋白可能会对肉凝胶结构起负面效应［4］;McCord等人认为，添加商业SPI降低了肌肉蛋白的凝胶强度［5］;Feng等人指出，未经变性的native SPI对乳化香肠质构没有影响，但经热处理和Alcalase水解后的SPI则提高了香肠硬度［6］。可以推测，以上不一致结果很可能是因为所添加的native SPI、水解物和商业SPI结构不同、所含组分也不同导致的。

商业SPI在工业生产过程中，通常会经历一定程度的变性和聚集，导致溶解度的降低，形成水不溶性的聚集体或沉淀［7-9］，同时也会形成一部分可溶性聚集体［10］。不同商业SPI的生产厂家由于工艺参数不同，可溶/不溶性聚集体比例不同，其产品的在肉制品中的应用效果往往也不尽相同。另外，酶解作为一种常见的蛋白改性方法常被用于破坏蛋白结构形成不同肽链片段，从而提高蛋白的功能性质［11］。SPI的酶解物已被报道可以改善肉制品的风味和保水性［12］。Feng等人曾报道SPI经Alcalase酶解后的可溶和不溶性混合水解物能够显著提高香肠的硬度［6］。

本研究探讨了SPI的可溶性水解物、可溶/不溶性聚集体对乳化香肠肉糜流变学性质、香肠蒸煮得率、质构和微观结构的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

鲜猪后腿瘦肉、去皮猪肥膘，购于大润发超市;肠衣为直径2.2 cm的胶原蛋白肠衣，购自淄博龙宝生物食品有限公司;商业SPI，益海嘉里秦皇岛金海工业公司提供;Alcalase碱性蛋白酶，美国Novozymes公司;HCl和NaOH等，为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司;大豆、盐、糖等为市售。

1.2 仪器

Avanti J-26 XP高速冷冻离心机，美国Beckman公司;SevenEasy pH计，瑞士梅特勒-托利多公司;0.45 μm微滤膜(Type HV)和100 kDa纤维素超滤膜，美国Millipore公司;BJRJ-12T台式绞肉机，嘉兴艾博不锈钢机械工程有限公司;CM-14斩拌机，西班牙Mainca公司;TB-46灌肠机，永康市泰宝电器五金厂;Rational Selfcooking center 61E蒸烤箱，德国Rational公司;AR-G2流变仪，美国 TA公司;TA-XT Plus质构仪，英国 Stable Micro Systems公司;XL-30 ESEM环境扫描电镜，荷兰Philips公司。

1.3 实验方法

1.3.1 天然大豆分离蛋白(SPI)的制备

大豆首先去皮、粉碎、脱脂［m(豆粉)∶V(正已烷)∶V(乙醇)=3∶9∶1］得到脱脂豆粕。参考Ramirez-Suarez等［13］的“碱溶 -酸沉 -中和”方法提取SPI并冷冻干燥(视为native SPI)、研磨成粉末，真空包装后保存在-20℃冰箱中。

1.3.2 SPI酶解物的制备

按1.3.1制备的native SPI用超纯水配制成质量分数为5.5%的溶液后，转移至50℃循环水浴加热的酶反应器中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH 8.0后，添加碱性蛋白酶Alcalase(酶活≥2.4 U/g，酶底比为1∶100)，同时滴加0.1 mol/L的NaOH维持pH值为8.0，直至蛋白水解度达到4%。根据 pH-stat方法［14］计算达到目标水解度时需消耗NaOH的体积。达到目标水解度后，80℃水浴加热15 min进行灭酶处理，放入碎冰中冷却后离心(10 000 g，15 min，4℃)取上清液调节pH 7.0并冷冻干燥(视为可溶性水解物)。

1.3.3 SPI可溶/不溶性聚集体的制备

商业SPI首先分散在超纯水中，配成质量分数1%的蛋白溶液，然后离心(10 000 g，15 min，4℃)。收集离心得到的沉淀，即为SPI的不溶性聚集体。离心得到的上清液首先通过0.45 μm的微滤膜去掉不溶性的蛋白大颗粒物质，然后利用100 kDa的纤维素超滤膜，被浓缩截留下来的蛋白部分即为分子量超过100 kDa的部分。根据分子质量分布测定可进一步确定该部分为分子质量大于1 000 kDa的可溶性聚集体。收集SPI可溶和不溶性聚集体分别冷冻干燥备用。将SPI可溶/不溶性聚集体干燥粉末按质量1∶1混合得到SPI混合聚集体。

1.3.4 乳化香肠的制备

1.3.4.1 基础配方［6］

纯SPI为2%，先用部分水溶胀SPI粉末为12%溶液，剩下冰水量斩拌时添加。

1.3.4.2 工艺流程

表1 添加不同SPI的乳化香肠配方Table 1 Formulation of emulsified sausages containing different soy protein isolate

1.3.4.3 关键操作要点

腌制:将糖、盐、等腌料和绞过的瘦肉搅拌均匀，在4℃下腌制24 h。

斩拌:将腌好的瘦肉和肥肉先斩拌3min，再添加预溶胀的不同SPI斩拌3min，用碎冰控制温度在10℃以下。

蒸煮:灌制好的乳化香肠均匀地放在蒸烤箱中，将温度探头插入一根香肠的几何中心。80℃加湿蒸煮至中心温度达到72℃，再快速冷却至室温。

1.3.5 流变性质

参考Álvarez等人的方法［15］，利用流变仪在小幅振荡模式下测定乳化肉糜的动态弹性模量(G')变化。具体实验参数是:使用直径为2 cm的平板夹具，对肉糜样品进行温度扫描，以2℃/min的速率从20℃升至80℃，最大应变为0.02，频率为5 Hz，样品厚度为1 mm。最后，在样品和夹具边缘滴加硅油，以便防止样品的水分蒸发，并在夹具外面扣上保护盖。

1.3.6 蒸煮得率

乳化香肠用胶原蛋白肠衣灌肠后(每隔10 cm用棉线打结为一根)编号称重，蒸煮冷却后再次按各编号分别称重。每组样品重复测定10根取平均值。

蒸煮得率/%=(香肠经蒸煮后的质量/蒸煮之前香肠的质量)×100

1.3.7 全质构分析(TPA)

乳化香肠剥去肠衣，切成2 cm高的圆柱体。使用质构仪进行TPA分析，设定的主要参数是:探头类型:P/36R;测前速度:3.0 mm/s;测定速度:3.0 mm/s;测后速度:5.0 mm/s;压缩比:60%。每个样品做10次平行，取平均值。记录硬度、黏聚性和咀嚼性的测定结果。

1.3.8 微观结构

参考Plucknett等人［16］的方法，利用XL-30 ESEM环境扫描电镜(ESEM)观察乳化香肠的微观结构。从香肠内部切出一小片厚度约为3 mm的样品，用电镜专用双面胶粘贴在ESEM的圆形样品台上，再放入ESEM样品室中，先抽真空再加压。测试条件为:加速电压20 kV，恒压0.7 Torr，样品室温度8℃，放大倍数为800倍。样品观察时间控制在5 min以内，以避免长时间暴露导致样品失水。

1.3.9 数据处理与统计分析

本实验数据如无特别说明，均为2次重复3次平行获得的平均值，使用origin 8.5作图。使用Statistix 9的一般线性程序进行方差分析，采用最小显著差数法(LSD)对数据进行显著性统计分析(P＜0.05)。

2 结果与讨论

2.1 不同类型SPI对乳化肉糜弹性模量的影响

分别添加了SPI可溶性水解物和可溶/不溶性聚集体的乳化肉糜，其弹性模量(G')随温度升高的变化如图1所示。

图1 大豆蛋白可溶性水解物和可溶/不溶性聚集体对乳化肉糜弹性模量的影响Fig.1 Effects of soluble hydrolysate and soluble/insoluble aggregates of soy protein isolate on the elastic modulus of meat emulsion

在20～40℃内，所有肉糜样品的G'值呈现出下降的趋势，这可能是因为温度升高时，样品内部蛋白之间的氢键作用逐渐被破坏。所有样品的G'值再上升至50℃达到峰值，下降到60℃达到最低值后，G'值迅速增加，表明肉糜状态由黏性溶胶向弹性凝胶网络转变。乳化肉糜的这种流变性质模式与已经报道的肌纤维蛋白凝胶和乳化型凝胶相吻合［15，17-18］。与未添加任何SPI的空白肉糜相比，添加SPI的不溶性聚集体和混合可溶/不溶性聚集体都很显著地提高了肉糜的弹性模量(P＜0.05)，而单独添加SPI的可溶性聚集体对肉糜没有明显的影响。添加未变性native SPI肉糜的G'值低于未添加SPI的空白肉糜，这一结果与native SPI在肌肉蛋白中的负面效果一致。添加SPI酶解物也显著破坏了肉糜的凝胶网络形成。

2.2 不同类型SPI对乳化香肠蒸煮得率的影响

如图2所示，与空白香肠相比，添加不同类型的SPI(native，酶解物和聚集体)都显著提高了香肠的蒸煮得率。其中，含有SPI不溶性聚集体的香肠蒸煮得率最高，比不添加任何SPI的空白香肠蒸煮得率高了4%(P＜0.05)。这可能是因为不溶性聚集体的添加起到一定的空间填充效应，使香肠结构变得更致密，空隙变少，提高了连续相中的有效蛋白浓度，从而增强了蛋白的保水量［19］。此外，这种由不溶性聚集体诱导形成的香肠致密结构也可能起到一定的锁水作用，在蒸煮过程中对香肠内部的水分蒸发起到物理阻碍的屏障效应。另外，SPI的酶解物也提高了香肠的蒸煮得率，这是因为有限水解能够促使大豆蛋白的天然紧凑结构解离，形成亚基和带电极性基团(NH3+，

COO-)，从而增强蛋白的束水能力［6，11］。

图2 大豆蛋白可溶性水解物和可溶/不溶性聚集体对乳化香肠蒸煮得率的影响Fig.2 Effects of soluble hydrolysate and soluble/insoluble aggregates of soy protein isolate on the cooking yield of emulsified sausage

2.3 不同类型SPI对乳化香肠质构的影响

添加不同类型SPI对香肠质构的影响如表2所示。与不添加任何SPI的空白香肠相比，添加SPI不溶性聚集体的香肠硬度、黏聚性和咀嚼性均显著提高(P＜0.05)。添加SPI可溶性聚集体和native SPI对香肠质构都没有明显影响，但SPI水解物则显著破坏了香肠的质构。结合香肠的微观结构可以看出，SPI的不溶性聚集体至少部分以“填充物”的形式分布在香肠的蛋白网络结构中，香肠结构紧密，并改善了香肠的质构。SPI不溶性聚集体的这种“填充物”效应提高香肠质构的情况类似于脂肪球增强肌肉蛋白凝胶强度［19］。

值得一提的是，Feng等人曾经报道添加SPI的Alcalase水解物(DH4)显著提高了乳化香肠的质构［6］，而本研究却发现，SPI经Alcalase水解后显著削弱了香肠的质构。分析产生2种截然相反结果的原因，很有可能是源自二者添加的SPI水解物成分的极大差异。Feng等人是将SPI的水解物全部添加到香肠中，其中包括经水解产生的可溶部分的多肽段和发生疏水聚集的不溶性沉淀;而本研究是将SPI的水解物离心后，仅取其可溶部分添加到香肠中。该可溶性的多肽段很可能破坏瓦解肌肉蛋白凝胶网络的形成，从而在宏观上表现出质构比不添加任何SPI的空白香肠差。同时，根据该SPI水解物组分差异引起的相反结果，似乎也可以从侧面帮助推测出SPI的不溶性聚集体或沉淀物具有改善香肠质构的有利作用。

表2 大豆蛋白可溶性水解物和可溶/不溶性聚集体对乳化香肠质构的影响Table 2 Effects of soluble hydrolysate and soluble/insoluble aggregates of soy protein isolate on the texture of emulsified sausage

2.4 不同类型SPI对乳化香肠微观结构的影响

利用环境扫描电镜(ESEM)观察了添加不同SPI对香肠微观结构的影响，如图3所示。与传统扫描电镜(SEM)相比，环境扫描电镜无需干燥、喷金等前处理，可以直接观察含水样品在原始状态下的微观结构，比如 β-乳球蛋白［20］、明胶/糊精混合凝胶［21］。从图3可以看出，未添加任何SPI的香肠呈现出具有纤维状、棒状、多孔的网络结构，这与Feng等人使用普通扫描电镜(SEM)观察到的空白香肠结构一致［6］。添加native SPI的香肠结构较粗糙、空隙较大。添加SPI水解物的香肠看上去比较松散细碎，缺少了连续的绳状交联网络结构，这可能是因为SPI经水解后形成的小分子多肽段干扰了肌肉蛋白相互间的交联反应。添加SPI的可溶性聚集体后，可以看到香肠的凝胶网络结构密度增强，空隙变小。而添加的SPI不溶性聚集体似乎像填充物一样，使得香肠结构更连续紧实，空隙较少，这种更紧密的交互式结构很可能有利于提高香肠蒸煮得率和质构。

图3 大豆蛋白可溶性水解物和可溶/不溶性聚集体对乳化香肠微观结构的影响(ESEM，放大倍数800)Fig.3 Effects of soluble hydrolysate and soluble/insoluble aggregates of soy protein isolate on the microstructure of emulsified sausage(ESEM，magnification:×800)

3 结论

与不添加任何SPI的空白香肠相比，添加native SPI、SPI的可溶性水解物和可溶/不溶性聚集体均显著提高了乳化香肠的蒸煮得率。native SPI较明显地降低了肉糜的弹性模量，但对香肠的质构没有明显影响;SPI的可溶性水解物显著地破坏了香肠的质构和凝胶网络结构;SPI的可溶性聚集体对乳化肉糜的弹性模量和香肠质构没有明显影响，但在一定程度上改善了香肠的微观结构;SPI的不溶性聚集体很显著地提高了肉糜弹性模量和香肠质构，并诱导形成了较连续紧密的香肠结构。本研究结果说明了商业SPI中的不溶性聚集体部分对香肠品质的改善作用，对乳化香肠用商业SPI的生产具有一定的指导意义。

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