子痫前期和正常妊娠患者血清及胎盘组织中sFlt－1的表达研究

西北妇女儿童医院妇产科（西安710003） 俞春芝 赵现立

子痫前期是妊娠期特有的疾病，可伴全身多器官功能损害或功能衰竭，严重者出现抽搐，昏迷甚至死亡。子痫前期的病因至今尚未完全阐明，其发病可能与胎盘滋养细胞缺血，血管内皮损伤及功能失调有关［1］。可溶性血管内皮细胞生长因子受体－1（sFlt－1）在参与滋养细胞浸润以及血管生成及调控过程中发挥重要作用，本研究通过检测子痫前期和正常妊娠患者血清sFlt－1的浓度变化，胎盘组织中sFlt－1蛋白和mRNA的表达水平，探究sFlt－1的表达与子痫前期发病的相关性。

资料与方法

1 一般资料 选择我院2013年至2014年2月住院病例共60例，子痫前期组40例（其中轻度子痫前期20例，重度子痫前期20例），平均年龄28±3岁，平均孕周36±4周，子痫前期的诊断标准及分类参照文献［2］。同期住院的正常妊娠者20例为对照组，平均年龄27±2岁，平均孕周38±4周。两组孕妇均为初产妇，单胎妊娠，排除内科合并症和其他产科并发症，分娩方式以剖宫产终止妊娠。

2 方 法 ①标本采集：临产前，无胎膜早破，子痫前期组在接受药物治疗之前空腹抽取肘静脉血3ml，室温放置30min，自凝后离心分离血清，置－20℃冰箱保存待检。各组患者剖宫产术中胎盘娩出后20min内取胎盘中央约2cm×2cm×2cm大小的两块组织，标本均分为两份，l份置10%福尔马林溶液固定24h备用，另1份放于无菌Eppendorff管，15min内置于液氮中保存，以待RNA提取。②血清sFLt－1测定：采用ELISA法检测血清sFLt－1水平。用奥地利Bender公司ELISA试剂盒，用校正稀释液代替血清标本作为阴性对照。③胎盘组织中sFlt－1蛋白的表达：常规组织脱水和石蜡包埋制成3μm厚的连续切片，经HE染色后，采用SP法。免疫组化操作步骤按PV6000免疫组化试剂盒（北京中山生物技术有限公司产品）说明书进行。PBS代替一抗作为阴性对照。阳性结果判断标准：标本组织细胞质或基质中有黄色和（或）棕黄色颗粒。④RT－PCR技术检测sFlt－1mRNA表达水平：总RNA提取：按Trizol说明书提取总RNA；引物合成：根据已知基因序列设计引物，sFlt－1基因为525bp，GAPDH 基因为226bp；RT－PCR半定量分析：根据Promega公司试剂盒，将组织总RNA逆转录为cDNA。PCR扩增sFlt－1基因及内参照基因GADPH。sFlt－1 扩增条件为 94℃ 45s、65℃ 45s、72℃45s，24个循环。GADPH扩增条件为94℃45s、52℃45s、72℃45s，21个循环。2% 琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，电泳结果用计算机扫描分析，以各标本sFlt－1和GADPH扩增条带的实际灰度值的比值表示sFlt－1mRNA的表达水平。

3 统计学分析 采用SPSS 10．0统计软件包进行统计学分析。结果以±s表示，t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组孕妇血清sFlt－1水平比较 见表1。轻度及重度子痫前期患者血清中sFlt－1水平显著高于正常妊娠组（P均＜0．05）。轻度及重度子痫前期患者两组之间血清中sFlt－1水平差别具有统计学意义（P＜0．05）。

2 各组孕妇胎盘组织中sFlt－1蛋白表达比较见表2。轻度及重度子痫前期患者胎盘组织中sFlt－1蛋白表达强度明显高于对照组（P＜0．05）。重度子痫前期患者胎盘组织中sFlt－1蛋白表达高于轻度组 （P＜0．05）。

表1 各组血清sFlt－1测定结果（±s，μg／L）

表1 各组血清sFlt－1测定结果（±s，μg／L）

注：与对照组比较 ＊P＜0．05，与轻度组比较△P＜0．05

组 别 n 20 7．53±2．51轻度子痫前期组 20 23．51±3．12＊重度子痫前期组 20 35．68±4．16 sFlt－1对照组＊△

表2 各组孕妇胎盘组织中sFlt－1蛋白表达的比较（±s）

表2 各组孕妇胎盘组织中sFlt－1蛋白表达的比较（±s）

注：与对照组比较 ＊P＜0．05，与轻度组比较△P＜0．05

组 别 n 阳性细胞率（%） 光密度OD值20 21．61±2．51 36．72±3．18轻度子痫前期组 20 51．24±3．18＊ 79．31±2．71＊重度子痫前期组 20 55．48±4．37＊△ 82．24±3．52对照组＊△

3 各组孕妇胎盘组织sFlt－1mRNA表达的比较见表3。轻度及重度子痫前期患者sFlt－1mRNA平均灰度比值则显著高于对照组（P＜0．05）。重度子痫前期患者血清中sFlt－1mRNA表达高于轻度组（P＜0．05）。

表3 各组孕妇胎盘组织sFlt－1mRNA相对表达量的比较（±s）

表3 各组孕妇胎盘组织sFlt－1mRNA相对表达量的比较（±s）

注：与对照组比较 ＊P＜0．05，与轻度组比较△P＜0．05

组 别 n 20 0．15±0．03轻度子痫前期组 20 0．78±0．02＊重度子痫前期组 20 0．86±0．04 sFlt－1mRNA对照组＊△

讨 论

妊娠期高血压疾病的病因和发病机制尚不明确，其发病可能与胎盘滋养细胞缺血，血管内皮损伤及功能失调有关。近来，胎盘浅着床理论逐渐为多数学者所认可［3］。正常妊娠时，子宫螺旋小动脉管壁平滑肌细胞，内皮细胞凋亡，代之以绒毛外滋养细胞，且深达子宫壁的浅肌层。充分的螺旋小动脉重铸使血管管径扩大，形成子宫胎盘低阻力循环以满足胎儿生长发育的需要。但妊娠期高血压患者的滋养细胞浸润过浅，只有蜕膜层血管重铸，俗称“胎盘浅着床”。螺旋小动脉重铸不足使胎盘血流量减少，胎盘的缺血，缺氧可使胎盘释放因子，引起子痫前期一系列表现［4－5］。

可溶性血管内皮生长因子受体1（sVEGFR－1或sFlt－1）是血管内皮生长的因子（VEGF）的可溶性受体，主要是由胎盘产生，具有可分泌性，组织中自然分泌产物较少，属于稀有剪接形式［3－4］。sFlt－1能与内皮细胞表面受体kDR和Flt1形成异源二聚体，最终阻断血管内皮生长因子（VEGF）和胎盘生长因子（PIGF）的生物学效应，造成全身内皮功能失调，产生高血压，蛋白尿等临床表现［6］。

本研究通过检测子痫前期患者血清中sFlt－1水平和胎盘组织中sFlt－1mRNA的表达水平，了解sFlt－1的表达与子痫前期发病的相关性和预期相关性。sFlt－1检测可用于临床对子痫前期的早期诊断中，期望成为早期筛查子痫前期的指标，给予抑制sFlt－1活性的药物将更有效的改善其症状，提高孕产妇及新生儿的预后质量。

［1］ Pijnenborg R，Vercruysse L，Verbist L，et al．Interaction of interstitial trophoblast with placental bed capillaries and venules of normotensive and pre－eclamptic pregnancies［J］．Placenta，1998，19：569－575．

［2］ 乐 杰．妇产科学［M］．7版．北京：人民卫生出版社，2009：99－101．

［3］ Maynard SE，Moore TA，Bur L，et al．Soluble endoglin for the prediction of preeclampsia in a high risk cohort［J］．Hypertens Pregnancy，2010（3）：330．

［4］ Foidart JM，Schaaps JP，Chantraine F，et al．Dysregulation of anti－angiogenic agents （sFlt－1，PLGF，and sEndoglin in preeclampsiaa step forward but not the definitive answer［J］．J Reprod Immunol，2009，82（2）：106－111 ．

［5］ Makris A，Thornton C，Thompson J，et al．Uteroplacental ischemia results in proteinuric hypertension and elevated Sflt－1［J］．Kidney Int，2007，71（10）：977－984．

［6］ 陶娅玲，漆洪波．子痫前期孕妇血清及尿液中 VEGF、PLGF、sFlt－1水平变化及意义［J］．实用妇产科杂志，2008，24（8）：496－498．