张晋蔚,钱 江,何玉巧,杨丽华,林楚慧,郑文玮,王 响,胡满江,陈骁熠
(广州医科大学公共卫生学院,广东广州510182)
慢性便秘是临床常见的复杂症状,长期便秘造成有害物质在肠道堆积,产生过量的自由基、炎症介质、细胞因子[1]使肠黏膜受损甚至诱发心脑血管疾病、结直肠癌等严重的并发症。流行病学调查表明,受慢性便秘影响的人群已经高达20%[2],尤其多见于中老年人和体弱多病者[3]。天然产物相对于药物在治疗慢性便秘中具有毒副作用小、安全性高的优点,然而传统用于通便的大黄和番泻叶如果长期使用容易引起结肠黑变病和增加患结肠癌的风险[4]。因此,探求一种长期有效且无毒副作用的天然产物具有重要意义。
肠道粘膜是抵御有害物质氧化损伤的第一道屏障[5],因此增强肠道粘膜的抗氧化能力是治疗慢性便秘的重要手段。研究发现槲皮素等黄酮类化合物能够通过抗氧化作用改善小鼠肠粘膜的氧化损伤[6]。松针食用历史悠久[7-8],安全性高[9],其中的黄酮类化合物、胡萝卜素、原花青素等天然抗氧化剂能够清除自由基,增强抗氧化能力[10-11],保护肠黏膜,维持肠道功能。现代药理实验表明松针的抗氧化性对心血管疾病[12]、糖尿病[13]、肿瘤[14]等慢性疾病有积极的防治作用,但对其通便功能鲜有报道。本研究拟通过评价肠道抗氧化能力和通便作用等方面考察松针提取液对慢性便秘小鼠的影响,以期增加松针开发利用的附加值,并为治疗慢性便秘提供理论依据。
复方地芬诺酯片 长春长红制药有限公司;马尾松松针 采自湖北;大黄 购于大参林药房;复方地芬诺酯片 江苏康普药业;丙二醛(MDA)试剂盒,超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒、一氧化氮(NO)试剂盒 均购于南京建成生物工程研究所;其它试剂 均为分析纯;昆明小鼠,雄性,SPF级,体重(18~22g) 由广东省动物实验中心提供。
AK-98超细中药粉碎机 温岭市奥力;DK-8D电热恒温水槽 上海一恒科技;X-22R低温台式高速离心机 美国Beckman Coulter公司;UV-3900紫外可见分光光度计 日本日立。
1.2.1 松针提取液的制备 称取新鲜松针,洗净,剪成0.5~1cm长,粉碎松针至可通过20目筛后,称取松针粉 60、3、1.5g于烧瓶中,加入 60mL 蒸馏水,在90℃条件下热浸提120min,冷却后减压抽滤,分别得到 1∶1、1∶20、1∶40(g∶mL)松针提取液。大黄磨粉后,以1∶20(g∶mL)料液比在松针提取液相同条件下浸提制得大黄提取液。
1.2.2 动物分组及处理 将76只健康昆明小鼠随机分成空白组与便秘组,空白组给予生理盐水,便秘组给予复方地芬诺酯(5mg/kg BW)造模。两周后,测定两组小鼠体重及结肠丙二醛(MDA)含量。再将便秘组按体重随机分成便秘组、1∶1、1∶20 和 1∶40 松针组、1∶20大黄组,便秘组给予生理盐水,其余各组给予相应提取液进行干预,共10d。各组小鼠在第7d进行通便作用评价,第10d处死小鼠,取出样本进行测定。
1.2.3 小鼠通便作用的评价 第6d干预后,各组小鼠禁食不禁水16h,各小鼠给予等量墨汁灌胃,立即放至铺有滤纸的鼠笼内,每笼小鼠1只,并恢复饲料和饮水,同时开始准确计时。观察记录每只小鼠首粒黑便排出用时,并连续观察5h,记录5h小鼠黑便的粒数,同时记录黑便的性状,并及时称量排出黑便的湿重。
1.2.4 小鼠结肠丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的测定 末次干预1h后,眼球取血,静置2h 后,3500r/min,4℃离心 15min,制备血清,检测血清中NO的含量。剖开处死后小鼠的腹腔,分离肠系膜,剪取距离回盲部1cm处大肠组织2cm,按照试剂盒提供方法测定其 MDA、NO的含量和SOD、GSH-Px的活性。
1.2.5 统计学分析 实验数据通过 SPSS20.0软件进行统计分析,各组计量资料的描述采用均数±标准差(±s),使用单因素方差分析(ANOVA)及Dunnett-t检验进行组间差异比较,p<0.05表示差异有显著性。
由表1可知,与空白组比较,造模两周后,便秘组体重明显减轻(p<0.05),说明慢性便秘会造成小鼠体重减轻。而便秘组MDA含量与空白组比较明显升高(p<0.01),表明慢性便秘能够增加结肠组织氧化程度。
表1 慢性便秘对小鼠体重及结肠MDA含量的影响(±s,n=8)Table 1 The effect of chronic constipation on body weight and colonic MDA content(±s,n=8)
表1 慢性便秘对小鼠体重及结肠MDA含量的影响(±s,n=8)Table 1 The effect of chronic constipation on body weight and colonic MDA content(±s,n=8)
注:与空白组比较,*p <0.05,**p <0.01。
组别 体重(g) 结肠MDA含量(nmol/mL)34.15 ± 1.55 0.76 ± 0.40便秘组 31.23 ± 1.44* 1.62 ± 0.44空白组**
如表2所示,与空白组比较,便秘组的MDA含量显著增加,SOD与GSH-Px活性显著降低(p<0.01)。说明在停药10d后,便秘小鼠肠道的氧化程度仍比正常小鼠高,而抗氧化酶活性降低。与便秘组比,各提取液均能显著降低结肠组织的MDA含量(p<0.01),三组松针提取液均能显著提高SOD活性(p<0.05),而大黄提取液能提高SOD活性,但差异不显著。研究显示只有1∶1松针提取液能显著提高GSH-Px的活性(p<0.01),其余各组效果不显著。结果说明松针提取液能够提高结肠抗氧化能力,减少结肠的氧化损伤。
表2 松针提取液对慢性便秘小鼠结肠MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影响(±s,n=10)Table 2 The effect of pine needle extract on antioxidant capacity of chronic constipated mice(±s,n=10)
表2 松针提取液对慢性便秘小鼠结肠MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影响(±s,n=10)Table 2 The effect of pine needle extract on antioxidant capacity of chronic constipated mice(±s,n=10)
注:与空白组比较,*p<0.05,**p < 0.01;与模型组比较,#p <0.05,##p <0.01,表 3,表 4 同。
组别 MDA含量(nmol/mL)SOD活性(U/mL)GSH-Px活性(U/mL)2.61 ± 1.11 22.22 ± 6.14 41.47 ± 18.40便秘组 5.58 ±2.25** 14.02 ±2.73** 35.93 ±14.02**1∶20 大黄 1.94 ± 0.40## 16.73 ± 0.93 30.68 ± 15.19 1∶40 松针 2.55 ± 1.28## 22.46 ± 5.83## 48.40 ± 19.31 1∶20 松针 3.22 ± 1.10## 22.45 ± 7.26# 45.09 ± 15.37 1∶1 松针 2.84 ± 0.91## 24.95 ± 9.77## 55.28 ± 11.93空白组##
由表3可知,与空白组比较,便秘组小鼠首粒黑便排出用时明显延长,5h内黑便粒数和黑便重量明显减少,结果均具有显著性差异(p<0.05),且经过7d停灌复方地芬诺酯,便秘小鼠的排便功能仍得不到改善,说明慢性便秘小鼠模型稳定。与模型组比较,1∶40松针提取液对黑便重量增加不显著(p>0.05)但可以减短首粒黑便排出用时及增加粒数(p<0.05),其余各提取液均能明显缩短便秘小鼠首粒黑便排出用时(p<0.01),增加5h内黑便的粒数和重量(p<0.05)。结果表明,经过松针和大黄提取液干预后,小鼠便秘得到缓解。
表3 松针提取液对慢性便秘小鼠排便的影响(±s,n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on laxative activity of chronic constipated mice(±s,n=10)
表3 松针提取液对慢性便秘小鼠排便的影响(±s,n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on laxative activity of chronic constipated mice(±s,n=10)
组别 首粒黑便排出用时(min)黑便粒数(粒)黑便重量(mg)84.22 ± 22.83 13.75 ± 6.43 455.07 ± 28.19便秘组 121.80 ±35.75** 8.17 ±4.31* 365.04 ±124.75*1∶20 大黄 95.85 ± 16.13# 17.00 ± 4.29## 461.80 ± 63.00#1∶40 松针 85.52 ± 10.61## 13.17 ± 4.12# 435.08 ± 35.15 1∶20 松针 65.14 ±15.57## 14.33 ±3.98# 444.53 ±21.62#1∶1 松针 69.93 ± 28.75## 14.83 ± 4.07# 459.38 ± 46.51空白组#
表4结果显示,便秘小鼠血清和结肠中NO的含量均比空白组显著升高(p<0.01);各剂量组与便秘组相比,均能显著降低便秘小鼠中血清与结肠中NO的含量。说明松针与大黄皆能减少NO的产生和作用。
表4 松针提取液对慢性便秘小鼠血清及结肠NO含量的影响(±s,n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on serum and colonic NO content of chronic constipated mice(±s,n=10)
表4 松针提取液对慢性便秘小鼠血清及结肠NO含量的影响(±s,n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on serum and colonic NO content of chronic constipated mice(±s,n=10)
组别 血清NO含量(μmol/g)结肠NO含量(μmol/g)12.95 ± 5.60 4.70 ± 0.62便秘组 40.09 ±7.13** 20.19 ±13.51**1∶20 大黄 21.02 ± 5.79## 14.63 ± 6.37#1∶40 松针 23.16 ± 6.79## 13.99 ± 5.32#1∶20 松针 30.87 ± 11.15## 10.63 ± 6.10##1∶1 松针 21.56 ± 11.54## 4.85 ± 4.32空白组##
为研究慢性便秘对肠道的氧化作用,本研究参考刘海峰[15],包云光[16],智会[17]等使用大鼠造模方法,成功得到稳定的小鼠慢性便秘模型,并首次检测到结肠的MDA含量升高(p<0.01)(表1),结果证明慢性便秘可以造成肠道的氧化损伤。这可能由于小鼠服用复方地芬诺酯后,抑制了肠道蠕动功能,使肠内容物长时间停留在肠道内。肠内容物中的有害物质如吲哚、亚硝胺、酚类等长时间对肠黏膜造成刺激,产生的炎症介质、自由基等[1]不断攻击肠道上皮黏膜、使肠黏膜受到氧化损伤,进而影响肠道的消化及代谢功能,最后导致体重减轻(p<0.05)(表 1)。
本实验对慢性便秘小鼠进行干预后发现,不同浓度的松针提取液均能明显增强结肠的抗氧化能力。松针提取液富含芦丁、槲皮素、叶绿素等多种抗氧化物质,能够调剂体内的氧化应激反应[18],加快自由基的清除,减少脂质过氧化产物MDA的产生。同时,松针提取液也可以通过明显提高SOD的活性(p<0.05)(表2),增强便秘小鼠肠道内源性抗氧化能力,使肠道免受自由基的损伤[10]。
本实验还发现,不同浓度的松针提取液均能够降低体内NO的水平减少肠道的氧化损伤。NO亦属于自由基。便秘小鼠肠道内的有害物质会促使肠道菌群产生过量的内毒素,进而激活巨噬细胞和白细胞产生大量的NO[19]。而过量的NO能够导致细胞因子网络的失衡,从而产生炎症反应[20],损伤肠黏膜,降低肠道功能。在松针提取液干预后,便秘小鼠血清和结肠中的 NO含量明显减少(p<0.05)(表4),小鼠的肠道损伤明显降低。
从表3看出松针提取液能够明显缩短便秘小鼠排首粒黑便的用时,并能够增加排黑便的粒数和湿重。表明经过松针提取液干预后,肠道功能得到一定程度恢复,便秘症状得到缓解。本实验中,由于三组松针是在不同料液比的条件下进行提取,各提取液中活性物质的含量和组成各不相同,因此对小鼠体内的抗氧化活性和排便的效果也有所不同。
本研究通过使用松针提取液对慢性便秘小鼠进行干预,发现松针提取液能够缓解慢性便秘致小鼠结肠的氧化损伤,提高肠道的抗氧化能力,进而改善小鼠的通便功能。本研究为开发松针通便功能性食品提供了理论依据。
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