滩涂植物碱蓬籽中总酚的提取工艺优化

王新红，王京平，朱 玮

(江苏省滩涂生物资源与环境保护重点实验室，江苏盐城师范学院化学化工学院，江苏盐城224051)

碱蓬(SuaedaglaucaBge)是蔾科(Chenopodiaceae)碱蓬属(Suaeda)植物［1］，常称为“海英菜”、“碱蒿”、“盐蒿”，是典型盐生植物［2］。碱蓬的鲜嫩茎叶营养丰富，籽粒的脂肪含量高达36.4%，远高于大豆(18.8%)［3］。另外，碱蓬的茎叶中含有大量的人体所必需的氨基酸、维生素、胡萝卜素和 Cu、Zn、Ca、Fe、Mn、P、Se 等微量元素［3-4］，其中有许多指标都高于螺旋藻。此外也可做动物饲料［5］，可做肥皂、油漆，可用于印染、玻璃工业等［6］，是化学工业的原料。综上可见，在食用、保健、药用方面，碱蓬的研究和开发价值很大，由此也引起了许多学者的关注［7-9］，经 SCI和 EI数据库检索，及国内 CNKI检索结果发现，涉及碱蓬的相关研究主要是碱蓬中的黄酮类物质［7］、蛋白［8］、甜菜红素［9］、多糖［10］等的提取研究，但未见有对碱蓬中总酚的提取及工艺优化方面的相关报道。

本实验通过超声提取的方法从碱蓬籽中提取总酚［11］，研究在不同的温度、不同的提取时间、不同的料液比及不同的乙醇的体积分数下的总酚的含量(total phenolic content，TPC)，通过响应面分析法优化［12］并确定最佳工艺参数，获得回归模型，并验证。为碱蓬在食品、医药、化学工业等行业的进一步分析、开发及应用提供理论基础和应用依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

福林酚试剂、没食子酸、无水乙醇、碳酸钠 上海国药集团;其他试剂均为分析纯。实验用水均为二次蒸馏水。碱蓬籽于2012年10月在盐城大丰海堤采摘，清洗后在60℃下烘干至恒重，粉碎后过60目筛，密封放置4℃的条件下待用。

SPECORD-50紫外分光光度计 德国耶拿公司;KQ-300E超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;SHB-IIIT循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线及总酚的测定 根据文献［12］的方法，稍作修改:精确称取0.100g没食子酸，加蒸馏水定容至100mL，分别移出 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL 至100mL 容量瓶，浓度为 0、10、20、30、40、50、60、70μg/mL没食子酸溶液。再取1mL各浓度没食子酸溶液，加入1mL福林酚试剂(1∶1)，然后加入3mL 7.5%碳酸钠溶液，在 25℃下反应 30min，在765nm下测定吸光度值。以吸光度A和没食子酸溶液浓度进行线性拟合，得线性回归方程:y=0.019x+0.1707，R2=0.9912，其中 x 是食子浓度(μg/mL)，y值是吸光度A。与上述方法同，测定不同工艺得到的碱蓬籽提取液的吸光度A，总酚的提取量则可根据下式进行计算:TPC(μg/g)=(A-0.1707)(料液的体积(mL)/［0.019(碱蓬样品的质量(g)］。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 乙醇体积分数的选择 准确称取1.000g研磨后的碱蓬籽置于25mL容量瓶中，按料液比1∶20，分别加入浓度为30%、50%、70%、90%、100%的乙醇20mL，提取2次，每次取一半体积的溶剂提取，两次提取液合并后离心，取出上层清液1mL，测定溶液中总酚的含量，从而选择总酚含量最高的乙醇体积分数进行后序实验。

1.2.2.2 提取时间的选择 按料液比1∶20加入90%的乙醇，在 40℃超声仪中分别浸提 0.5、1.0、1.5、2.0h，提取2次，每次取一半体积的溶剂提取，两次提取液合并后离心，取上层清液1mL，测定溶液中总酚的含量，从而选择最佳的提取时间。

1.2.2.3 提取温度的选择 按料液比1∶20加入90%的乙醇，分别在 20、40、60、80℃超声仪中浸提 30min，提取2次，每次取一半体积的溶剂提取，两次提取液合并后离心，取上层清液1mL，测定溶液中总酚的含量，从而选择最佳的提取温度。

1.2.2.4 料液比的选择 原料按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 加入 90%乙醇，在 80℃ 条件下浸提 1h，提取次数为2次，合并两次提取液，离心后，取上层清液，测定溶液中总酚的含量，从而选择最佳的料液比。

1.2.3 响应面分析 根据单因素实验的结果，选取依照响应面分析法中的Box-Behnken Design中心组合法设计并优化提取工艺。以总酚提取量为响应值，4因素3水平的实验设计见表1。实验数据的处理均采用Design Expert7.1.6软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 乙醇体积分数 根据实验方法1.2.2中的单因素实验方法研究不同的乙醇体积分数对碱蓬中总酚提取量的影响实验，在40℃的温度下，时间为30min，料液比为1∶20的提取条件下，结果如图1。由图1可见，碱蓬中的总酚的提取量随着乙醇浓度的升高而增加，当乙醇浓度达到90%，总酚的提取量达到此时提取条件下的最大值，这是由于有机溶剂乙醇量的增加抑制了多酚与植物基质中其他组分的反应而提高了多酚的溶出率，继续升高乙醇浓度，总酚提取量增长的幅度下降。这可能与溶剂中乙醇量加大，而水含量减小引起了水溶性的酚类物质的溶出率减小有关。因此，后续实验选择乙醇的体积分数为80%、90%、100%进行优化分析［13］。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Experimental factors and levels using RSM

图1 乙醇体积分数对总酚提取量的影响Fig.1 Effect of volume fraction of ethanol on TPC

2.1.2 提取时间 在料液比固定为1∶20，加入90%的乙醇溶剂，温度设定40℃，提取时间分别为20、40、60、80min时，研究碱蓬提取液中总酚的含量与时间的影响关系，结果见图2。如图2所示，当提取时间逐渐增加时，总酚的提取量随时间的增加而增加，达到60min后，总酚的提取量达到最大值，60min后，总酚的提取量开始出现下降趋势。这可能由于随着时间的增加，碱蓬籽中总酚提取量增大到了实验条件下的最大溶出值，而之后总酚的提取量显示下降，可能是提取时间的增加也引起碱蓬细胞基质中其他组分的溶出增加，从而溶剂的粘度增加，溶质多酚的输出速率受到阻碍而减小的缘故。因此选择提取时间为40、60、80min 进行优化。

2.1.3 提取温度的选择 以料液比1∶20加入90%的乙醇，提取时间设定60min，研究温度分别为20、40、60、80、85℃时碱蓬中总酚提取量的影响，结果见图3。当提取温度到60℃时，总酚的提取量还在增加，到80℃时，提取量增加幅度逐渐减缓，甚至到85℃时，提取量开始有下降趋势，原因可能与总酚物质在高于80℃后会破坏其结构而发生降解有关，所以实验选择40、60、80℃为后序优化温度。

图2 时间对总酚提取量的影响Fig.2 Effect of extraction time on TPC

图3 温度对总酚提取量的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on TPC

2.1.4 料液比 原料按料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40g/mL 时加入 90%乙醇，在 80℃ 条件下浸提60min，测定溶液中总酚的含量，结果如图4。当料液比逐渐增加时，多酚的提取量逐渐增加，随后随着溶剂量的增加，总酚提取量又出现下降，这可能是因为溶剂量的增加，致使多酚与空气的接触机会增加，加速了多酚的氧化，所以提取量反而减小。从节约溶剂的角度考虑，选择料液比为1∶20。

图4 料液比对总酚提取量的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on TPC

2.2 提取工艺的响应面优化分析

2.2.1 实验结果及模型 依照表1中的设计进行实验，响应值的实验值见表2。

利用Design Expert软件对表1实验数据进行回归拟合，得到三次方的回归模型为:

2.2.2 验证结果 通过Design-Expert软件，得出最优提取条件为:乙醇体积分数为80%，时间为80min，温度为80℃，料液比为23.42g/mL，理论最大提取率为996.94μg/g。验证实验把料液比修正为23g/mL，测定三次实验的提取量分别为 997.62、989.81、970.66μg/g，平均值为 986.03μg/g，RSD%=1.41，这说明该方程与实际情况符合得较好，该软件的优化条件合理。

表2 响应面结果表Table 2 Results of response surface methodology

3 结论

测定碱蓬籽中总酚含量的测定实验中的四个影响因素除外，超声仪的功率也是主要因素之一。另外，文中得出的最优工艺参数中，温度80℃已经达到了仪器设定温度的上限，在优化工艺条件下得到多酚量的预测值可能也不是最佳值。但实验数据可以作为碱蓬多酚提取工艺的基本参考数据。目前对于天然植物中的总酚的提取方法应用广泛的还有微波辅助提取法，都优于传统的热回流法、索氏提取、浸取法等。另外提取溶剂的选择应该朝向绿色化、环保型发展，离子液体是目前发展前景极好的选择。对于这部分研究目前本工作室正在进行中。期望对于湿地、耐盐、耐寒、及具有多种活性，且在食品、医药、工业应用广泛的植物——碱蓬的研究提供可用的信息。

表3 回归分析结果Table 3 Results of regression model and analysis of variance

［1］赵可夫，李法曾 .中国盐生植物［M］.北京:科学出版社，1999.

［2］张学杰，樊守金，李法曾.中国碱蓬资源的开发利用研究状况［J］.中国野生植物资源，2003，22(2):1-3.

［3］谷奉天.开发盐地碱蓬绿色系列食品研究［J］.滨州教育学院学报，1999，5(3):43-48.

［4］周东生，王奇志，王鸣，等.盐地碱蓬化学成分及其开发利用的研究进展［J］.中国野生植物资源，2011，30(1):6-9.

［5］吴咏梅，赵清，张云生，等 .特用植物——盐地碱蓬［J］.新疆畜牧业，2001(3):22-23.

［6］孙宇梅，赵进，周威，等.我国盐生植物碱蓬开发的现状与前景［J］.北京工商大学学报:自然科学版，2005，23(5):1-4.

［7］黄晓昆，黄晓冬，卞美君.南方碱蓬叶黄酮类化合物含量及其体外抗氧化活性研究［J］.安徽农业科学，2010，38(3):1432-1434.

［8］衣丹，刘发义，臧家业，等.响应面法优化碱蓬叶蛋白提取工艺研究［J］.食品工业，2011，(10):52-54.

［9］王昭晶.碱蓬水溶性多糖SPB的分离纯化以及活性的初步研究［J］.食品科技，2010，35(9):236-238.

［10］高雪，王倩，李珂，等.高效液相色谱法优化盐地碱蓬甜菜红素提取工艺研究［J］.食品工业科技，2011，32(3):259-261.

［11］罗仓学，史兰，李振尧.菜籽粕总酚提取工艺优化［J］.中国食品添加剂，2013(4):136-142.

［12］王新红，吴秀红，左玉香.紫茉莉种外皮总酚提取工艺响应面法优化研究［J］.北方园艺，2013，286(7):147-150.

［13］陈海光，刘朝霞，于立梅.山竹果皮中总酚类物质的抗氧化性研究［J］.食品工业科技，2011，9:107-115.