DHEA衍生物的稳定性研究

黄阿三　林森　杨建云等

[摘 要] 目的：通过破坏试验（强酸、强碱、氧化）考察建立高效液相色谱法的专属性；研究影响因素试验（高温、高湿、光照）中DHEA衍生物的外观性状、有关物质及含量的变化，初步考察其稳定性。方法：利用高效液相色谱法，通过与对照品比较，观察变化情况。结果：在高温和光照条件下，DHEA衍生物都比较稳定；在高湿条件下，虽然性状仍为白色粉末，但其含量会有所降低，只有99.4%。结论：DHEA衍生物在所有考察条件中均很稳定，但会引湿增重，故保存过程中应注意防潮。

[关键词] DHEA衍生物；高效液相色谱法；破坏试验；影响因素试验；稳定性

中图分类号： o623.7 文献标识码： A 文章编号：2095-5200（2014）06-062-03

DHEA衍生物（derivative of DHEA，化学名为5β-雄甾烷-3α，17β-二醇）是一种具有合成作用的睾酮前体类固醇药物，为天然的肾上腺皮质激素类，具有抗糖皮质激素活性的作用。人体肝脏里有一种3β-羟基类固醇脱氢酶可以把它转化为睾酮，因此它是一步转化，不经中间体代谢。且有实验证明DHEA衍生物的免疫调节作用，具有显著增加循环嗜中性粒细胞、血小板和NK细胞的功能[1-4]。由于DHEA衍生物与人体的生理活动密切相关，因此，需增加对DHEA衍生物的了解，以便更好地发挥DHEA衍生物的生理学作用、减小或消除DHEA衍生物的生理学危害。

本课题组建立了DHEA衍生物的RP-HPLC的检测方法，成功地将其与有关物质进行了分离，建立了工作曲线，检测限低至33ng。但是，对于DHEA衍生物稳定性的研究却未见报道[5]，而DHEA衍生物的稳定性对高效发挥其药用作用有重要指导意义。因此，本文主要开展关于讨论DHEA稳定性的实验。

本文预期通过酸、碱、氧化破坏试验引起DHEA衍生物的降解，应用所建立的RP-HPLC方法检测降解后的物质，得到破坏试验后DHEA衍生物的含量信息，从而获知酸、碱、氧化破坏试验对DHEA衍生物稳定性的影响，为药物可能的降解途径和降解机制提供实验依据。为进一步探讨DHEA衍生物的固有稳定性，并了解影响其稳定性因素，进行了DHEA衍生物的影响因素（温度、湿度、光线）试验，通过HPLC法分析其含量、性状和有关物质随时间的变化，为制剂生产工艺、包装、贮存条件和建立降解产物分析方法提供依据。本法方便、快速、灵敏度高、专属性强、精密，结果准确可靠。

1 实验部分

1.1 仪器和药品

Waters 600-717-996 型高效液相色谱仪（二极管阵列检测器，自动进样器，美国）；电子分析天平（Sartorius，BP211D）；恒温水浴锅（B-260，上海亚荣生化仪器厂）；真空超声波清洗仪（KQ-6030，江苏省昆山市超声仪器有限公司）；色谱柱：Diamonsil C18（4.6mm×250mm，5μm）；乙腈（色谱纯，禹王试剂）；水（娃哈哈纯净水）；盐酸（AR，北京化学试剂公司）；氢氧化钠（AR，汕头西陇化工有限公司）；30%双氧水（AR，国药集团化学试剂有限公司）；硝酸钾（AR，国药集团化学试剂有限公司）；DHEA衍生物均由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供批号（20120514）。

1.2 色谱条件

1.3 试验方法

1.3.1 破坏试验 取DHEA衍生物约30mg，置25mL量瓶中，进行如下酸、碱、氧化破坏试验。

1.3.1.1 酸破坏 滴加1 mol/L的盐酸溶液 10mL，于90℃水浴中加热8h，再加1 mol/L的氢氧化钠溶液，调节pH至中性，过滤，将固体晾干后，加乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，取上清液按“1.2”项下的色谱条件进样分析。

1.3.1.2 碱破坏 滴加1 mol/L的氢氧化钠溶液10mL，于90℃水浴中加热8h，再加1 mol/L的盐酸溶液，调节pH至中性，过滤，将固体晾干后，加乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，取上清液按“1.2”项下的色谱条件进样分析。

1.3.1.3 氧化破坏 滴加30%的过氧化氢溶液10mL，放置三天后于90℃水浴中加热8h，过滤，将固体晾干后，加乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，取上清液按“1.2”项下的色谱条件进样分析。

在酸、碱、氧化破坏实验中，由于DHEA衍生物几乎不溶于水，所以破坏后过滤取其滤渣加乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，取上清液按“1.2”项下的色谱条件进样分析。

1.3.2 影响因素试验 稳定性研究的考察项目应选择在药品保存期间易于变化，并可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的项目，以便客观、全面地反映药品的稳定性。以下为影响因素稳定性研究的一般要求。

1.3.2.1 高温试验 取DHEA衍生物开口置适宜的洁净容器中，60℃温度下放置10天，于第5天和第10天取样，加乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，按“1.2”项下的色谱条件进行检测，并与0时间的比较。

1.3.2.2 高湿试验 取DHEA衍生物开口置恒湿密闭容器中，在25℃分别于相对湿度90%±5%（下部放置KNO3饱和溶液）条件下放置10天，于第5天和第10天取样，加乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，按“1.2”项下的色谱条件进行检测，并与0时间的比较，结果见表2。

1.3.2.3 光照试验 取DHEA衍生物开口放在装有日光灯的光照箱内，在照度为4500lx±500lx的条件下放置10天，于第5天和第10天取样，加乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，按“1.2”项下的色谱条件进行检测，并与0时间的比较。

2 结果

分别选用1mol/L盐酸溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、30%过氧化氢溶液进行破坏性试验。由表1可知，样品经过酸、碱及氧化破坏后主峰面积均在99.5%以上，也没有杂质降解，结果与对照品（99.53%）一样，在实验过程中，为了能够提高降解强度，我们从0.1 mol/L浓度一直提高到1mol/L，并且温度也从一般的室温20℃一直尝试加热到90℃，考察的时间也延长到8h，大大增加了降解条件强度，但试验结果均没有产生新的降解产物。试验中，主峰的峰面积和保留时间基本上保持不变，由此也可以说明DHEA衍生物没有被降解，主峰与有关物质的分离度也比较好，所以在这些条件下DHEA衍生物相对稳定。endprint

由表2可知，DHEA衍生物在高温、光照条件下外观性状均为白色粉末，没有变化，含量也相对稳定。在中国药典中，原料药的稳定性试验中高温试验的温度一般不超过60℃，但我们也曾试将温度升高（至105℃）以达到降解破坏的目的，但主峰的含量及保留时间基本上还是保持不变，所以在高温、光照试验中都可以说明DHEA衍生物比较稳。在高湿条件下虽然性状仍为白色粉末，但其含量会有所降低，只有99.4%，这是由于DHEA衍生物易吸收水分引起的，故DHEA衍生物在生产、贮存、运输中应注意密封并保持干燥。有关物质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的峰面积百分比也基本不变，而且它们能够很好的和主峰分开，分离度都大于1.5。由此也再一次证明所建立的方法专属性强。对于表2中峰面积百分比大于0.1的有关物质Ⅲ通过HPLC、UV、GC-MS进行了结构分析，发现它为反应原料之一DHEA，并非为新降解的产物，故在影响因素考察试验中DHEA衍生物稳定性很好。

3 结论

本文通过HPLC法分析DHEA衍生物在温度、湿度、光照环境中的稳定性进行了全面的研究，并提供了具体的实验数据。

经1mol/L盐酸溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、30%过氧化氢溶液的破坏性试验后，主峰的保留时间没有发生改变，未破坏出降解产物。且主峰的分离度均大于1.5。

在高温、光照条件下放置10d，各项指标无明显变化，对热稳定，对光照稳定，DHEA衍生物的含量均在99%以上；在高湿（RH 90%±5%）环境中易吸水使其含量降低至99.4%。故其原料样和相关制剂的生产、运输和贮存过程中应尽可能的避免高湿。

目前无法在破坏试验中得到降解产物，说明DHEA衍生物在这些条件下稳定，可以为以后的相关制剂提供了参考。

本法方便、快速、灵敏度高，结果准确可靠，专属性强。

参 考 文 献

[1] Langell J， Jennings R， Clark J， et al. Pharmacological agents for the prevention and treatment of toxic radiation exposure in spaceflight[J]. Aviation， space， and environmental medicine， 2008， 79（7）： 651-660.

[2] Stickney D R， Dowding C， Authier S， et al. 5-androstenediol improves survival in clinically unsupported rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2007， 7（4）： 500-505.

[3] Stickney D R， Dowding C， Garsd A， et al. 5-androstenediol stimulates multilineage hematopoiesis in rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2006， 6（11）： 1706-1713.

[4] Neta R. Modulation with cytokines of radiation injury： suggested mechanisms of action[J]. Environmental health perspectives， 1997， 105（Suppl 6）： 1463.

[5] Shen Dongni， Yang Jianyun， Xiao Bingkun， Huang Rongqing*， RP-HPLC Determination of Content of Derivative of DHEA and Its Related Substances. Modern Scientific Instruments[J]. 2013， 2： 124-25

[6] 国家药典委员会.中国药典[M].2010年版，北京，2010：二部，附录.endprint

由表2可知，DHEA衍生物在高温、光照条件下外观性状均为白色粉末，没有变化，含量也相对稳定。在中国药典中，原料药的稳定性试验中高温试验的温度一般不超过60℃，但我们也曾试将温度升高（至105℃）以达到降解破坏的目的，但主峰的含量及保留时间基本上还是保持不变，所以在高温、光照试验中都可以说明DHEA衍生物比较稳。在高湿条件下虽然性状仍为白色粉末，但其含量会有所降低，只有99.4%，这是由于DHEA衍生物易吸收水分引起的，故DHEA衍生物在生产、贮存、运输中应注意密封并保持干燥。有关物质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的峰面积百分比也基本不变，而且它们能够很好的和主峰分开，分离度都大于1.5。由此也再一次证明所建立的方法专属性强。对于表2中峰面积百分比大于0.1的有关物质Ⅲ通过HPLC、UV、GC-MS进行了结构分析，发现它为反应原料之一DHEA，并非为新降解的产物，故在影响因素考察试验中DHEA衍生物稳定性很好。

3 结论

本文通过HPLC法分析DHEA衍生物在温度、湿度、光照环境中的稳定性进行了全面的研究，并提供了具体的实验数据。

经1mol/L盐酸溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、30%过氧化氢溶液的破坏性试验后，主峰的保留时间没有发生改变，未破坏出降解产物。且主峰的分离度均大于1.5。

在高温、光照条件下放置10d，各项指标无明显变化，对热稳定，对光照稳定，DHEA衍生物的含量均在99%以上；在高湿（RH 90%±5%）环境中易吸水使其含量降低至99.4%。故其原料样和相关制剂的生产、运输和贮存过程中应尽可能的避免高湿。

目前无法在破坏试验中得到降解产物，说明DHEA衍生物在这些条件下稳定，可以为以后的相关制剂提供了参考。

本法方便、快速、灵敏度高，结果准确可靠，专属性强。

参 考 文 献

[1] Langell J， Jennings R， Clark J， et al. Pharmacological agents for the prevention and treatment of toxic radiation exposure in spaceflight[J]. Aviation， space， and environmental medicine， 2008， 79（7）： 651-660.

[2] Stickney D R， Dowding C， Authier S， et al. 5-androstenediol improves survival in clinically unsupported rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2007， 7（4）： 500-505.

[3] Stickney D R， Dowding C， Garsd A， et al. 5-androstenediol stimulates multilineage hematopoiesis in rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2006， 6（11）： 1706-1713.

[4] Neta R. Modulation with cytokines of radiation injury： suggested mechanisms of action[J]. Environmental health perspectives， 1997， 105（Suppl 6）： 1463.

[5] Shen Dongni， Yang Jianyun， Xiao Bingkun， Huang Rongqing*， RP-HPLC Determination of Content of Derivative of DHEA and Its Related Substances. Modern Scientific Instruments[J]. 2013， 2： 124-25

[6] 国家药典委员会.中国药典[M].2010年版，北京，2010：二部，附录.endprint

由表2可知，DHEA衍生物在高温、光照条件下外观性状均为白色粉末，没有变化，含量也相对稳定。在中国药典中，原料药的稳定性试验中高温试验的温度一般不超过60℃，但我们也曾试将温度升高（至105℃）以达到降解破坏的目的，但主峰的含量及保留时间基本上还是保持不变，所以在高温、光照试验中都可以说明DHEA衍生物比较稳。在高湿条件下虽然性状仍为白色粉末，但其含量会有所降低，只有99.4%，这是由于DHEA衍生物易吸收水分引起的，故DHEA衍生物在生产、贮存、运输中应注意密封并保持干燥。有关物质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的峰面积百分比也基本不变，而且它们能够很好的和主峰分开，分离度都大于1.5。由此也再一次证明所建立的方法专属性强。对于表2中峰面积百分比大于0.1的有关物质Ⅲ通过HPLC、UV、GC-MS进行了结构分析，发现它为反应原料之一DHEA，并非为新降解的产物，故在影响因素考察试验中DHEA衍生物稳定性很好。

3 结论

本文通过HPLC法分析DHEA衍生物在温度、湿度、光照环境中的稳定性进行了全面的研究，并提供了具体的实验数据。

经1mol/L盐酸溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、30%过氧化氢溶液的破坏性试验后，主峰的保留时间没有发生改变，未破坏出降解产物。且主峰的分离度均大于1.5。

在高温、光照条件下放置10d，各项指标无明显变化，对热稳定，对光照稳定，DHEA衍生物的含量均在99%以上；在高湿（RH 90%±5%）环境中易吸水使其含量降低至99.4%。故其原料样和相关制剂的生产、运输和贮存过程中应尽可能的避免高湿。

目前无法在破坏试验中得到降解产物，说明DHEA衍生物在这些条件下稳定，可以为以后的相关制剂提供了参考。

本法方便、快速、灵敏度高，结果准确可靠，专属性强。

参 考 文 献

[1] Langell J， Jennings R， Clark J， et al. Pharmacological agents for the prevention and treatment of toxic radiation exposure in spaceflight[J]. Aviation， space， and environmental medicine， 2008， 79（7）： 651-660.

[2] Stickney D R， Dowding C， Authier S， et al. 5-androstenediol improves survival in clinically unsupported rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2007， 7（4）： 500-505.

[3] Stickney D R， Dowding C， Garsd A， et al. 5-androstenediol stimulates multilineage hematopoiesis in rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2006， 6（11）： 1706-1713.

[4] Neta R. Modulation with cytokines of radiation injury： suggested mechanisms of action[J]. Environmental health perspectives， 1997， 105（Suppl 6）： 1463.

[5] Shen Dongni， Yang Jianyun， Xiao Bingkun， Huang Rongqing*， RP-HPLC Determination of Content of Derivative of DHEA and Its Related Substances. Modern Scientific Instruments[J]. 2013， 2： 124-25

[6] 国家药典委员会.中国药典[M].2010年版，北京，2010：二部，附录.endprint