美洲鲥的胚胎发育研究

宓国强，练青平，汪亚平，胡廷尖，李 倩

(1.浙江省淡水水产研究所，浙江 湖州 313001;2.淳安千渔网箱养殖专业合作社，浙江 杭州 311700)

美洲鲥(Alosa sapidissima)属鲱科(Clupeidae)西鲱属(Alosa)，栖息于北美洲大西洋东西沿岸的河流和海洋中，为溯河产卵洄游性鱼类［1］。因美洲鲥与中国鲥(Macrura reevesii)的外形相似，味道可与我国鲥鱼媲美，深受市场欢迎，市场价格在400 元/kg 左右。近几年来，我国从美国引进美洲鲥的受精卵进行孵化和种苗培育，并逐步开展成鱼的池塘和网箱养殖［2-8］。但一是由于美洲鲥的受精卵是由在美国当地的野生群体人工受精获得，数量有限。二是受精卵从美国运到中国需20 h 以上，加上两地水温差异，造成鱼苗的孵化率不高，也影响苗种的质量。因此，随着养殖规模的逐步扩大，美洲鲥受精卵供不应求。为了满足日益增大的养殖美洲鲥所需要的苗种，摆脱完全依靠进口的被动局面，国内许多学者进行了美洲鲥的人工繁殖技术的研究探索，取得了一定成功，但尚难形成规模［9-15］。所以，有必要进行对淡水养殖下的美洲鲥进行全人工繁殖技术的研究。

2013 年5 月9 日，我们对2011 年6 月引进、在淳安千渔网箱养殖专业合作社的水库网箱养殖基地养殖3 年、性腺成熟的亲鱼进行了人工繁殖试验。本研究在美洲鲥人工催产、授精成功的基础上，对胚胎发育过程的时序和形态特征进行详细的观察，旨在为美洲鲥的人工繁殖和苗种生产提供理论指导。同时，也可丰富鱼类早期发育的内容。

1 材料和方法

1.1 亲鱼培育

试验用美洲鲥亲本来源于淳安千渔网箱养殖专业合作社的网箱养殖基地。该亲本是淳安千渔网箱养殖专业合作社于2011 年6 月从美国引入受精卵孵化后在网箱养殖而成，亲鱼体质量为1 000～1 300 g，鱼龄为3 龄。在养殖过程中，以投喂鲟鱼配合饲料为主。

1.2 人工授精与孵化条件

选取性腺成熟度好，体表无擦伤的美洲鲥作为试验亲鱼。亲鱼经注射催产激素后放回网箱中，用微流水进行刺激。催产激素为马来酸地欧酮(DOM)、促黄体素释放激素2 号(LHRH-A2)和绒毛膜促性腺激素(HCG)的混合激素。采用1 次注射，注射部位为背鳍基部，待效应时间到达后，采用半干法授精获得美洲鲥的受精卵，并将受精卵放入孵化缸中进行孵化。孵化用水为水库天然水，其水温为(21.5±0.5)℃，pH 为8.5，溶解氧为7.5～8 mg/L。

1.3 胚胎发育观察及数据统计方法

胚胎发育观察时，每次随机取30 枚受精卵，在ZOOM645S 连续变倍体视显微镜下进行观察，每次以50%以上的受精卵进入下一发育时期为准，并记录下胚胎发育各阶段的时序和形态特征。同时用CanonA700 型相机拍照。图片后期用Adobe Photoshop CS6 软件进行处理。胚胎发育的有效积温计算参照徐革锋等计算方法［16］。其胚胎发育积温计算公式如下:

K=T·N

式中:T 表示发育期间的平均水温(℃);N 表示完成某一发育时期所需要的时间(h);K 表示完成某一发育时期的发育所需要的有效积温(℃·h)。

2 结果分析

2.1 胚胎发育

根据实验结果，在孵化水温在(21.5±0.5)℃条件下，美洲鲥受精卵经过66 h 30 min 孵化出膜，鲥鱼受精卵完成胚胎发育所需的积温为1 463(℃·h)，胚胎发育进程见表1。按照胚胎发育的形态特征，可将美洲鲥的胚胎发育过程划分为7 个阶段:卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期、孵化出膜期。从受精至出膜共计29 个胚胎发育特征和发育时序见图1 和图2。

2.1.1 卵裂前期 发育至成熟的卵呈卵圆形，为金黄色或者浅黄色的沉性卵，卵黄均匀分布。美洲鲥的受精卵遇水开始吸水膨胀，卵膜透明，无粘性，无油球(图1-1)。受精卵卵裂方式为盘状卵裂，属端黄卵，约15～20 min 后吸水膨胀完成，最终卵径为(3.15±0.15)mm，卵周隙为0.8 mm。受精后30 min，积温达到11(℃·h)时，原生质由植物极向动物极迁移，此时，胚胎呈梨形，在动物极逐渐聚集隆起形成胚盘，胚盘形成(图1-2)。

表1 美洲鲥的胚胎发育Tab.1 Embryonic development ofAlosa sapidissima

2.1.2 卵裂期 受精后50 min，积温达到18.26(℃·h)时，在胚盘中央出现分裂沟，胚盘分裂成2 个大小相等的分裂球，进入2 细胞期(图1-3)，随着细胞的继续发育，受精后1 h 15 min，细胞再次分裂，分裂沟与第一次垂直，形成4 个大小相等的分裂球(图1-4)，受精后1 h 30 min，分裂球继续分裂，与第一次分裂面平行，形成8 个分裂球排成2 排，进入8 细胞期(图1-5)，此后，分裂球数目呈几何级数增长，分别继续发育至16 细胞、32 细胞、64 细胞期等(图1-6-7)。受精后4 h，积温达到88(℃·h)时，分裂球越分裂越小，越分裂越多，形成多细胞胚体(图1-8)，其大小犹如桑椹，此时进入桑椹期(图1-9)。

2.1.3 囊胚期 受精后5 h 10 min，积温达到113.74(℃·h)时，细胞分裂球越来越小，细胞界线不清楚，胚盘高度达发育期的最高，在动物极形成的囊胚层被卵黄高高举起，似帽状，进入囊胚早期(图1-10)。受精后6 h 35 min，囊胚层高度较囊胚早期变低，胚层逐渐趋向扁平，细胞已经向下扩散，囊胚层的面积正不断扩大，进入囊胚中期(图1-11)。受精后8 h 30 min，囊胚层细胞下包已经明显，约占整个胚胎的1/3，囊胚层变扁平，紧贴卵黄，进入囊胚晚期(图1-12)。

图1 美洲鲥的胚胎发育Fig.1 Embryonic development of Alosa sapidissima

2.1.4 原肠胚期 受精后12 h，积温达到264(℃·h)时，囊胚层边缘细胞向下包，内卷逐渐明显，约占整个胚胎的1/2，胚环出现，进入原肠早期(图1-13)。受精后14 h 30 min，胚层继续下包至2/3 处，胚盾出现，进入原肠中期(图1-14)。受精后15 h 25 min，胚层下包至3/4～4/5 处，胚盾逐渐伸长，较明显，进入原肠晚期(图1-15)。

2.1.5 神经胚期 受精后16 h，积温达到344(℃·h)时，胚层下包至4/5 处，卵黄栓和神经板形成，胚体转为侧卧，可见部分胚体，胚体未完全形成，胚胎进入神经胚期(图1-16)。受精后17 h，胚孔封闭，卵黄囊被全部包入，脊索形成柱状，胚体前部稍隆起，头部雏形形成，进入胚孔封闭期(图2-1)。

2.1.6 器官形成期 受精后24 h 10 min，积温达到519.65(℃·h)时，胚体前部隆起，胚体中部出现3～4 对肌节，整个胚体长度约为卵黄囊周长的1/3，进入肌节出现期(图2-2);受精后25 h 30 min，在胚体头部出现1 对长椭圆形眼囊，脊索更加明显，进入眼囊期(图2-3);受精后32 h 10 min，胚体伸长，在胚体后端出现圆锥形突起尾芽，胚体尾部和卵黄囊被分割，进入尾芽期(图2-4);受精后33 h 40 min，尾芽逐渐伸长，在眼杯中出现圆形的晶体，进入晶体出现期(图2-5);受精后37 h，在胚体尾部出现鳍褶，原先的尾芽变得扁平，在卵黄囊上出现许多星状的黑色素，此时进入尾鳍出现期(图2-6);受精后38 h 20 min，在脊索前方出现泡状耳囊(图2-7)。受精后40 h，在卵黄囊前上方，头部下方，管状心脏出现，开始微弱的心跳，心跳可达100～120 次/min，进入心跳期(图2-8);受精后42 h 55 min，胚体继续伸长，尾已基本形成，在胚体后部约占胚体的1/2 已经游离于卵黄，胚体开始表现出微弱的颤动，无规律性，扭动可达4 次/min，进入肌肉效应期(图2-9);受精后47 h 50 min，在眼囊后方的耳囊中出现1 对发亮的钙质耳石，进入耳石出现期(图2-10);受精后55 h 50 min，整个胚体包绕卵黄囊约3/4，眼球内部开始出现少量黑色素，而在卵黄囊上黑色素逐渐明显，进入眼色素形成期(图2-11)。

图2 美洲鲥的胚胎发育Fig.2 Embryonic development of Alosa sapidissima

2.1.7 孵化出膜期 受精后59 h 50 min，积温达到1 309(℃·h)时，眼色素继续加深，胚体在膜内转动加快20～25 次/分，进入出膜前期(图2-12);受精后66 h 30 min，眼色素继续加深，卵膜开始变薄，胚体体表无黑色素，胚体扭动次数增加且扭动幅度转为剧烈的颤动，为48～60 次/min，仔鱼出膜方式大多数以尾部先出膜，也有头部先出膜的，进入出膜期(图2-13)。

2.2 初孵仔鱼形态特征及活动情况

初孵仔鱼全长6.9～7.1 mm，体透明，卵黄囊上有分散的星状黑色素，眼晶体内黑色素明显，仔鱼卵黄囊较大，呈椭圆形，长径为(2.15±0.10)mm，短径为(1.9±0.15)mm，围心腔在卵黄囊前上方和头部下方，可见心跳，频率约140 次/min。在胚体的左右耳囊内可见2 颗耳石。初孵仔鱼口未开，消化道和肛门尚未发育贯通，初孵仔鱼无平游能力，只能静卧在水底或贴在孵化缸壁上，偶尔做直线窜动，具有显著的趋光性(图2-14)。

3 讨论

3.1 美洲鲥受精卵的特点

硬骨鱼类鱼卵分为浮性卵和沉性卵，而沉性卵又分为粘性卵、沉性卵，此类沉性卵密度稍大于水，在静水中沉入水底，在水流中能随流漂浮发育，亦称半浮性卵［17］。本研究发现美洲鲥受精卵属于沉性卵中的半浮性卵类型。与洪孝友等［10］和徐钢春等［15］等研究认为美洲鲥受精卵属沉性卵一致。中国鲥鱼报道为半漂浮性卵，其实也属沉性卵，与美洲鲥的受精卵类型应该一样。洪孝友等［10］研究报道美洲鲥受精卵径为2.85～3.28 mm，没有油球，与本研究中发现美洲鲥受精卵卵径(3.15±0.15)mm，无油球等结果一致，而与徐钢春等［15］研究报道美洲鲥受精卵径为(4.03±0.25)mm，不具油球结果不一致。原因可能是繁殖亲本的种群不同，也可能是亲本培育的环境、投喂的饲料不同所致。鱼类卵的大小对种的早期发育和存活具有重要的生态学意义，大卵在种内被认为有利于仔鱼建立初次摄食、生长、避敌和提高存活率［17］。美洲鲥的受精卵卵径要大于中国鲥鱼的卵径(1.37～2.20)mm［18］，这有助于美洲鲥在自然环境中提高存活率。

油球，又称油滴，是许多海产硬骨鱼卵的特殊组成部分，为内含中性脂肪，对浮性卵不仅是养料的储藏，也起浮子的作用。香鱼(Plecoglossus altivelis)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)等鱼卵都具有油球［19-20］，中国鲥鱼也具有油球，而美洲鲥不具有油球，这说明美洲鲥虽然属溯河产卵洄游性鱼类，与其自身的所适应的生态环境有关。

3.2 美洲鲥胚胎发育的特征

徐钢春等［15］研究认为美洲鲥受精卵在水温(20±1)℃条件下，历时约71 h 40 min 完成整个胚胎发育过程。洪孝友等［10］研究认为美洲鲥受精卵在水温(20.3～21.9)℃条件下，经过82 h 孵化出膜。本研究认为孵化水温在(21.5±0.5)℃条件下，美洲鲥受精卵经过66 h 30 min 孵化出膜，积温为1 463(℃·h)，其胚胎发育时间相差不大，基本相似。而中国鲥鱼在水温26.5～27.5 ℃条件下，鲥鱼受精卵经过17 h～18 h 30 min可孵化出膜，胚胎发育总积温需要438～481(℃·h)［17］，这可能是不同鱼类的种间差异所造成的。

美洲鲥的胚胎发育过程划分为7 个阶段，共计29 个发育时期，历时66 h 30 min，而中国鲥鱼胚胎发育分为22 个发育分期，历时17 h 发育出膜，其发育分期都基本相同，只是各分期发育时间间隔和发育速度不同。中国鲥鱼初孵仔鱼体长为2.71～2.87 mm，而美洲鲥出膜时候初孵仔鱼全长为6.9～7.1 mm，是中国鲥鱼初孵仔鱼体长的2 倍多，这对于物种的延续意义重大，在自然水域环境中可以很大程度上提高其幼鱼的成活率。

美洲鲥受精卵在孵化过程中，在胚胎发育到达原肠期时，其未受精的鱼卵就会变白停止发育，如把死卵继续留在孵化器具中，死卵很容易滋生水霉，这样会粘上正常发育的受精卵，造成美洲鲥受精卵孵化率降低，所以在受精卵孵化过程中，为了提高美洲鲥的出苗率，要及时人工剔除死卵，以保证正常发育的受精卵不被粘住。

研究认为硬骨鱼类受精卵胚胎发育进程随着孵化水温的升高而加快，其胚胎发育时间与孵化水温呈负相关。美洲鲥孵化温度为15.5～20.6 ℃时孵化幼苗成活率最大，温度低于7～9 ℃会很快导致卵和幼苗的死亡，温度超过23.4 ℃时会导致幼苗大部分出现畸形［6］。这与本实验中观察到的现象完全一致，在孵化水温超过23 ℃时，美洲鲥的出苗时候出现了大量的畸形苗，这就要求生产苗种单位要把美洲鲥受精卵孵化水温一直控制在23 ℃以下。

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