三种检测方法测定甲氨蝶呤血药浓度的比较分析

张媛媛，徐康康

(1.江苏省肿瘤医院药剂科，江苏 南京 210009;2.南京医科大学南京儿童医院医学装备部，江苏南京 210008)

甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)为叶酸类抗肿瘤药，临床上广泛用于治疗急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、绒毛膜上皮癌和骨肉瘤等恶性肿瘤。大剂量甲氨蝶吟(High Dose Methoterxate，HD-MTX)结合甲酰四氢叶酸钙(Calcium Folinate，CF)解救是目前急性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、骨肉瘤的重要治疗方案之一［1-2］。HDMTX化疗需要实施MTX血药浓度监测，指导解救药物CF的合理使用，避免MTX对患者造成的严重毒副作用［3-4］。

当前，国内外检测生物样品中MTX浓度的方法主要有免疫法和高效液相色谱法［5］。高效液相色谱法可将药物与代谢产物以及内源性物质分离，具有专一性强的特点，是检测MTX血浆浓度的金标准，但该法需复杂的前处理过程和较长的测定时间，不适合大样本的快速检测。尽管免疫法一定程度上会受到交叉反应的影响，但是其凭借快速、易操作的优点，已逐渐成为治疗药物监测的主要方法。而在MTX的生物药品检测中，均相酶放大免疫分析法(EMIT)方法更是逐渐成为快速检测甲氨蝶呤血药浓度的主要方法，将替代过去常用的荧光偏振免疫分析法(FPIA)方法。该方法保留了操作简便、自动化程度高、测定周期短等特点，但其说明书中仍提示“该系统在测定MTX时存在正偏差，MTX的一种代谢产物 4-氨基-4-脱氧-N-10-甲基喋酸(APA)的交叉反应会使测定值被高估”。这三种方法各有其优缺点，各有所长。本文希望通过对相同一份样品分别经3种方法分别检测的结果，讨论方法因素是否会对甲氨蝶呤血药浓度的检测产生影响，希望找出最有可能影响检测结果的方法。

1 材料

1.1 样本的收集 收集急性淋巴细胞白血病和恶性淋巴瘤患儿经HD-MTX化疗后采集的血液样本50份。将分离的血浆分成3份，于-45℃低温保存，1周内分别用HPLC法、FPIA法和EMIT法测定。

1.2 HPLC法仪器和试剂 Hp1100高效液相色谱仪;色谱柱为Zorbax SB-C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH 6.8)/甲醇(体积比 78/22)，流速:1.0 mL·min-1，柱温:40℃，检测波长:306 nm。甲氨蝶呤对照品(中国药品生物制品检定所，批号100138-200603)。

精密称取甲氨蝶呤对照品适量，置于100 mL容量瓶中，用 0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH6.8)溶解并稀释至刻度。得约1 mmol·L-1的MTX对照品储备液。置4℃冰箱保存，临用前稀释成所需浓度。

1.3 FPIA法仪器和试剂 雅培公司TDx-FLx药物浓度分析仪，Methotrexate II定标(批号80226Q 100)，Methotrexate II质控(批号94049Q100)，Methotrexate II试剂(批号90359Q101)。

1.4 EMIT法仪器和试剂 西门子公司Viva-E全自动药物浓度监测系统，Emit®Methotrexate定标(批号6L119UL-E1)，BIO-RAD Lyphochek®治疗药物监测质控(批号51793)，Emit® Methotrexate试剂(批号6L119UL-E1)。

2 方法

2.1 标准曲线 取空白血浆200 μL，准确加入MTX储备液，配制成相当于血中MTX浓度分别为0.0495，0.099，0.198，0.495，0.694，0.991 μmol·L-1的样品系列，经HPLC法绘制标准曲线。利用TDx-FLx和Viva-E血药浓度测定仪配套定标溶液绘制标准曲线。

2.2 精密度 选择高中低3个浓度的质控样品各一份，每份样品均由各自配套的仪器连续一日内连续测定6次和连续6日测定，分别计算日间和日内精密度。其中TDx-FLx和Viva-E血药浓度测定仪分别选择配套质控样品，HPLC法选取“2.1”项下高中低三个浓度的溶液作为质控样品。

2.3 稳定性试验 选取“2.2”项下各质控样品，在0 d，-45℃冷冻4、7 d后，分别在HPLC、TDx-FLx和Viva-E血药浓度测定仪上测定，考察稳定性。

2.4 MTX血浆药物浓度的测定 选用EDTA-K2抗凝静脉血标本，离心分离血浆，先后在 HPLC、TDx-FLx和Viva-E血药浓度测定仪上测定血浆中甲氨蝶呤浓度。每批次测定样本时需对质控品进行平行测定。

2.5 数据分析 分别用HPLC、TDx-FLx和 Viva-E血药浓度测定仪测定血浆中MTX浓度，样本的正态性检验采用Kolmogorov-Smimov法。如符合正态分布，利用配对样本t检验两两考察测定结果间是否存在差异，利用Deming回归两两考察测定方法之间的相关性;如不符合正态分布，则用Friedman检验和Wilcoxon检验等非参数检验方法和Passing-Bablok回归法进行分析。利用Bland-Altman偏差图比较两法测定结果均值的高低。

3 结果

3.1 标准曲线 HPLC法按“2.4”项方法处理后进样分析，以MTX峰面积Y对浓度X(μmol·L-1)进行线性回归，得回归方程:Y=17 205.3X-4 005.96。r=0.999 7。FPIA 和 EMIT 法采用各自定标溶液，由系统自动获取。

3.2 精密度测试结果 三种测定仪器均具有较好的批内和批间精密度，CV均＜7.50%(结果见表1)，其中在低浓度区间方法的精密度稍差。HPLC法三个水平质控品的质控品浓度分别为0.049 5，0.495，0.99 μmol·L-1;TDx-Flx 三个水平质控品的质控品浓度分别为 0.07，0.40，5.00 μmol·L-1;Viva-E系统三个水平质控品的质控品浓度分别为0.32，1.18，8.84 μmol·L-1。

表1 两种仪器的日内、批间精密度的测定结果(n=6)

3.3 稳定性实验结果 稳定性试验结果显示:样品经冻融后，分别经三种检测方法复测，检测结果稳定(CV＜7%)。HPLC、FPIA和EMIT法检测甲氨蝶呤的测定结果分别为(0.49 ±0.55)、(0.48 ±0.54)、(0.60 ±0.56)μmol·L-1。

3.4 数据分析 经Kolmogorov-Smirmov检验(P=0.011，P=0.017，P=0.014)，三组数据均符合正态分布。两两比较的差值配对 t检验结果(PHPLCvsFPIA=0.313，PHPLCvsEMIT＜0.01，PFPIAvsEMIT＜0.01)，提示HPLC法与FPIA法没有显著差别，而其它俩组都存在显著差别。

利用Bland-Altman偏差图比较两法测定结果均值的高低(图1)，结果显示:FPIA法测定结果较HPLC 法低 0.01 mmol·L-1(95%CI:-0.09 ～0.10 mmol·L-1);HPLC法测定结果较EMIT法低0.11 mmol·L-1(95%CI:-0.23 ～ 0.01 mmol·L-1);FPIA法测定结果较 EMIT法低0.12 mmol·L-1(95%CI:-0.23 ～ -0.01 mmol·L-1)。

经Deming回归法分析三种测定方法(图2)，Spearman检验两两考察不同测定方法结果的相关性:YHPLC=1.00 XFPIA+0.015(r=0.978，P ＜0.000 1);YHPLC=0.94XEMIT-0.079(r=0.956，P ＜0.000 1);YFPIA=0.95XEMIT-0.089(r=0.927，P ＜0.000 1)。

图1 三种测定方法测定结果的Bland-Altman图

图2 三种测定方法测定结果的Deming回归曲线

4 讨论

FPIA是根据荧光偏振原理建立的一种免疫分析方法，EMIT是一种酶放大免疫分析技术，二者均是利用免疫学原理进行特异性分析，测定结果会不同程度地受到的甲氨蝶呤两种代谢产物——APA和7-OH甲氨蝶呤(7-OH MTX)的交叉反应而影响［6-8］。HPLC法作为色谱分析法的一种，可以将药物原型及其代谢产物分离后，准确测定甲氨蝶呤的浓度，不受代谢物的影响。目前尚无研究同时考察三种测定方法，确定交叉反应引起的偏差大小。

许耘川［9］提示FPIA和HPLC法测定甲氨蝶呤血药浓度的结果之间不存在显著性差异。刘思婷［6］证实 EMIT方法比 FPIA法存在正偏差约0.2 mmol·L-1。吴先闯［10］的研究说明 EMIT 法比HPLC法存在约0.12 mmol·L-1的正偏差。但这种若干组两两比较的结果基于不同的待测样品，且样品数目也不同，无法通过偏差传递确定三种方法之间的大小关系。本文选用相同样本分别用三种方法分别测定，同时利用多配对样本的非参数检验方法，考察了三种检测方法之间的差异，用Bland-Altman图形直观的反映该差异［11］，同时通过回归分析法定量描述了不同检测方法间的换算关系。

由于地区发展水平不一致，色谱法和免疫法都将在甲氨蝶呤的治疗药物监测工作中发挥作用，讨论不同方法间的差异可以提高对于治疗药物监测数据的临床价值。随着新技术的发展，HPLC法和FPIA法由于各自的特点将在TDM工作中的应用将减少，但既往的检测结果仍具有很高的研究价值。只有定量分析了方法间的差异，才有可能对接既往数据和未来新的研究数据，对接不同研究单位之间的研究成果。对于新兴的EMIT法的研究证实存在显著的正偏差，因此需要在化疗中考虑到这个因素，回归分析结果可以帮助临床工作者将EMIT法测定结果换算成FPIA或HPLC估算值，减少代谢物对于临床治疗的误导作用。

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