枸地氯雷他定抗过敏性炎症作用实验研究

何广卫，储昭兴，李家明

(1.合肥医工医药有限公司，安徽合肥 230601;2.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230032)

过敏性疾病为临床常见病，现已成为世界上几乎所有国家的主要健康问题，被称为21世纪的疾病［1］。其发病机制主要涉及I型和Ⅳ型变态反应，组胺是引起过敏发生的最主要介质，其次为白三烯、前列腺素和白介素等。研究表明过敏性疾病后期多伴随炎症，如IL-5、TNF-α在哮喘和/或鼻炎的致病中发挥着重要作用［2］;IL-4、IL-10等炎症因子等参与过敏性哮喘的发病机制［3］;组胺与过敏性紫癜的发病机制有关［4］，也是I型过敏反应中最为重要的生物活性物质［5］;而PGE2和LTB4作为免疫细胞释放的重要炎症介质，还具有重要的免疫调节功能［6］。枸地氯雷他定(8-氯-6，11-二氢-11-(4-亚哌啶基)-5H-苯并［5－6］环庚［1，2-b］吡啶枸橼酸氢二钠盐二水合物)为新一代组胺H1受体拮抗剂，临床抗过敏疗效确切、毒副作用小，本文主要通过体外实验初步考察其对过敏后续的炎症反应的影响作用。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 枸地氯雷他定(南京海辰药业有限公司，批号:20121001)、依巴斯汀(武汉嘉凯隆科技发展有限公司批号:20111002)、盐酸左西替利嗪(武汉嘉凯隆科技发展有限公司，批号:20120722)、地塞米松注射液(辰欣药业股份有限公司，批号:1301251)，临用前均用1640细胞培养液溶解至所需浓度;RPMI1640培养液(吉诺生物医药技术有限公司，批号:20121228);类标准胎牛血清FCS(民海生物工程有限公司，批号:120618);卵蛋白OVA(Sigma公司，批号:A5253);PGE2及 LTB4ELISA试剂盒(南京凯基生物技术有限公司，批号:KGEM051，KGEM041);TNF-α、IL-4、IL-5 及 LTB4ELISA试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司，批号:EK0527，EK0405，EK0408)。

1.2 实验动物 ICR小鼠，雌雄各半，5～6周龄，体重(20±2)g，由浙江省医学科学院提供［合格证号:SYXK(浙)2008－0033］。

1.3 实验仪器 恒温培养箱NUAIR-NU-5510E(上海凌仪实业有限公司);生物安全柜BSC1300(上海博迅);酶标仪Spectramax M2e(美国Molecular Devices公司);倒置显微镜DMI3000B(德国Leica公司)。

1.4 实验方法［7］

1.4.1 致敏小鼠模型的构建及脾淋巴细胞的分离实验第1天于小鼠腹腔注射含卵蛋白(OVA)100 μg及氢氧化铝4 mg的0.9%NaCl注射液0.2 mL，第15天再次腹腔注射0.2 mL 0.9%NaCl注射液(含OVA 100 μg)构建OVA致敏的小鼠模型，第2次注射24 h后小鼠断颈放血。小鼠于75%酒精内浸泡3 min，无菌条件下取小鼠脾脏，手术剪剪碎后加50倍量0.5%胰酶，于37℃振荡消化15 min，过200目滤网，制备脾细胞悬液。用1640培养液调整细胞为2×106mL－1，加于24孔细胞培养板中，每孔1.5 mL。加各待测药物前于培养箱内静置12 h，待淋巴细胞沉于底部后，小心移去培养液，重新加新鲜培养液1 mL。

1.4.2 各待测药物对小鼠致敏脾淋巴细胞的预处理 枸地氯雷他定、盐酸左西替利嗪及地塞米松注射液用1640细胞培养液(含10%胎牛血清)稀释至所需浓度，0.22 μm微孔滤膜滤过除菌，依巴斯汀加DMSO助溶后稀释至所需浓度。枸地氯雷他定、依巴斯汀、盐酸左西替利嗪在各组淋巴细胞悬液中的终浓度分别为 0.15、1.5、15 μmol·L－1，地塞米松为1.5 μmol·L－1，DMSO 最终浓度 0.1%，共12 组，每组3个复孔。各组药物预处理后，加OVA(终浓度分别为200 mg·L－1)进行刺激，与37℃、5%CO2培养箱中孵育。

1.4.3 细胞培养上清液中各炎症因子释放水平的检测 以各组药物及OVA预处理后，孵育2 h，离心，收集培养上清液，以 ELISA法检测 LTB4及PGE2的水平;孵育9 h后收集培养上清液，ELISA法检测TNF-α水平;孵育36 h后收集培养上清液，ELISA法检测IL-4及IL-5水平，具体操作按照说明书进行。

2 结果

2.1 小鼠脾淋巴细胞经OVA刺激后LTB4、PGE2、IL-4、IL-5及TNF-α的表达 OVA致敏小鼠的脾淋巴细胞经OVA 再次刺激后，其LTB4、PGE2、IL-4、IL-5及TNF-α水平均高于正常对照组小鼠(P值均＜0.01)，见表1、表2，提示模型成功。

2.2 药物预处理后对 LTB4、PGE2、IL-4、IL-5 及TNF-α释放的影响 以不同浓度的枸地氯雷他定对致敏淋巴细胞进行预处理后，淋巴细胞培养上清的 LTB4、PGE2、IL-4、IL-5 及 TNF-α 水平均受到不同程度抑制，且其抑制程度随药物浓度的增加而增加，说明枸地氯雷他定对致敏小鼠淋巴细胞释放LTB4、PGE2、IL-4、IL-5 及 TNF-α 具有抑制效应并存在浓度依赖性。同时DMSO预处理组小鼠脾淋巴细胞培养上清的各炎症因子与正常对照组无明显差异，故可排除DMSO对炎症因子的非特异性抑制效应。

在相同作用浓度下，地塞米松抗炎活性最强，枸地氯雷他定高浓度组可获得与地塞米松相当的活性，与盐酸左西替利嗪和依巴斯汀相比，对PGE2释放的抑制作用枸地氯雷他定＞盐酸左西替利嗪＞依巴斯汀;对LTB4释放的抑制作用盐酸左西替利嗪＞枸地氯雷他定＞依巴斯汀;对TNF-α释放的抑制作用枸地氯雷他定＞盐酸左西替利嗪及依巴斯汀;三者对迟发相炎症因子IL-4及IL-5的释放均有显著抑制作用。见表1、2。

3 讨论

过敏性疾病亦称为变态反应性疾病，主要包括荨麻疹、过敏性鼻炎等，国内外流行病学资料表明，约有1/3以上的人一生曾患过敏性疾病，严重影响人们的生活质量、工作和学习，造成巨大的经济损失［8］，其病理生理过程中有炎症因子的参与，过去未对抗过敏药物是否具有抗炎症活性进行明确研究，但在近期的文献报道中越来越多的被涉及到，尤其是针对呼吸系统疾病如过敏炎症性哮喘等。

研究证明抗过敏药物孟鲁斯特和地塞米松均可通过抑制受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)、NF-KB等因子在气道末梢软组织的表达，降低嗜酸性粒细胞，从而改善OVA诱导的呼吸系统过敏性炎症豚鼠症状［9］;而阻断组胺H1受体可抑制骨髓系树突细胞(Bone-marrow Dendritic cells)IL-6和TNF-α表达，激活H1受体可以诱导TNF-α过表达，因此，H1受体已被证实与过敏性炎症有关［10］。

表1 枸地氯雷他定对OVA致敏小鼠淋巴细胞炎症因子IL-4、IL-5及TNF-α释放的影响(±s，n=3)

表1 枸地氯雷他定对OVA致敏小鼠淋巴细胞炎症因子IL-4、IL-5及TNF-α释放的影响(±s，n=3)

注:与正常组比较，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001;与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组别 IL-4/ng·L－1 IL-5/ng·L－1 TNF-α/ng·L －1 32.88 ±8.35 22.40 ±3.86 86.86 ±10.77模型 104.19±20.75△△ 61.72±9.00△△ 306.39±33.08△△△地塞米松/μmol·L －1 1.5 46.71 ±6.70＊＊ 30.50 ±4.03＊＊ 199.70 ±20.57＊＊枸地氯雷他定/μmol·L －1 0.15 76.02 ±12.49 53.37 ±5.52 254.83 ±18.48 1.5 58.96 ±8.04* 45.74 ±5.42 187.76 ±37.88*15 55.73 ±4.67* 33.62 ±3.79＊＊ 183.12 ±28.30＊＊依巴斯汀/μmol·L －1 0.15 95.78 ±4.99 55.62 ±7.23 294.59 ±42.25 1.5 71.56 ±9.67 38.78 ±3.82* 264.23 ±51.58 15 51.56 ±6.00* 34.89 ±5.26＊＊ 247.71 ±43.28盐酸左西替利嗪/μmol·L－1 0.15 96.26 ±8.58 49.56 ±5.78 270.61 ±40.19 1.5 59.56 ±5.45* 44.51 ±3.15* 239.29 ±26.17 15 55.44 ±7.49* 40.04 ±5.94*正常244.68 ±44.48

表2 枸地氯雷他定对OVA致敏小鼠淋巴细胞炎症因子PGE2及LTB4释放的影响(±s，n=3)

表2 枸地氯雷他定对OVA致敏小鼠淋巴细胞炎症因子PGE2及LTB4释放的影响(±s，n=3)

注:与正常组比较，△△P ＜0.01;与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组别 PGE2/ng·L－1 LTB4/ng·L －1 51.02 ±10.85 43.23 ±8.48模型 214.35 ±36.56△△ 178.93 ±41.99△△地塞米松 1.5 μmol·L－1 77.27 ±20.84＊＊ 57.72 ±5.61＊＊枸地氯雷他定/μmol·L －1 0.15 144.65 ±14.64* 128.70 ±12.40 1.5 124.50 ±18.73* 112.8 ±15.06 15 82.00 ±15.29＊＊ 94.08 ±11.20*依巴斯汀/μmol·L－1 0.15 199.63 ±16.31 163.31 ±20.46 1.5 179.60 ±18.46 148.18 ±14.79 15 161.46 ±16.21 108.45 ±13.80*盐酸左西替利嗪/μmol·L －1 0.15 185.34 ±17.43 124.18 ±14.79 1.5 159.60 ±22.88 106.34 ±15.60*15 130.61 ±13.14* 76.84 ±15.27正常*

枸地氯雷他定为H1受体拮抗剂，临床应用于急慢性荨麻疹、过敏性鼻炎等疾病，具有显著疗效，口服吸收快，起效时间短，半衰期长，作用持久且副作用较小，其中枢神经系统的抑制作用发生率较低，主要为口干和嗜睡现象发生［11］。最新研究发现，枸地氯雷他定临床上对老年性皮肤瘙痒［12］和面部皮炎［13］等炎症相关性疾病有显著治疗作用。

本文主要通过小鼠腹腔注射卵蛋白联合氢氧化铝胶体构建致敏动物模型，分离并培养小鼠脾淋巴细胞，考察枸地氯雷他定对 LTB4、PGE2、IL-4、IL-5、TNF-α等炎症相关因子的影响，探讨枸地氯雷他定体外抗过敏性炎症活性，并与依巴斯汀、盐酸左西替利嗪等同类药进行比较，为深入研究及证明枸地氯雷他定具有抗炎疗效提供依据。实验结果表明枸地氯雷他定不仅具有显著的体外抗炎症活性，在高浓度下还可获得与地塞米松相当的抑制效果。与盐酸左西替利嗪和依巴斯汀同类药物相比较，枸地氯雷他定更具备早期抗炎症的潜力。

对于枸地氯雷他定的抗过敏性炎症作用，还需在更多炎症模型上进一步验证，并阐明其与RANTES、NF-KB等因子的相互作用机制关系，但本文实验结果已证明其有在过敏性炎症疾病，尤其是气道过敏性炎症疾病方面有应用潜力。

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