细菌内毒素检查法在水胶体敷料临床使用安全性评价中的应用

许雷鸣，顾 倩，武 谷，堵伟锋，李 翔，林园园(.安徽省食品药品检验研究院，安徽合肥 005;.皖南医学院，安徽芜湖 4000;.解放军第74医院，福建 厦门 600)

水胶体敷料是在湿性愈合原理指导下发展起来的一类新型伤口敷料，由亲水性高分子颗粒与橡胶弹性体混合加工而成，集吸收性、对无创皮肤的黏性、隔离细菌等作用于一身，可应用于多种不同伤口的治疗，特别是对于慢性难愈性伤口具有显著疗效［1－2］。本试验根据《中国药典》2010年版二部“细菌内毒素检查法”［3］和 GB/T14233.2—2005 中的细菌内毒素试验［4］，以及相关细菌内毒素检查的文献［5－20］，对水胶体敷料应用鲎试剂进行细菌内毒素检查的可行性进行了研究，建立了水胶体敷料的细菌内毒素检查方法并采用凝胶半定量试验测定产品中的细菌内毒素含量，为评价临床应用水胶体敷料的安全性提供依据。

1 仪器与试药

VS-1300L-U洁净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)，S648恒温水浴锅(上海医疗器械七厂)，MS3 digital混旋仪(IKA)，微量取液器(50～250 μL，上海荣泰生化工程有限公司)，细菌内毒素检查用具(湛江博康海洋生物有限公司)。试验所用玻璃仪器均经250℃干烤2 h。

水胶体敷料3批(合肥某公司生产，批号为130220、121225、120510，规格:10 cm ×10 cm)。

鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司，批号:1209101，灵敏度:0.125 EU·mL－1，规格:每支 0.1 mL。湛江博康海洋生物有限公司，批号:1201052，灵敏度:0.125 EU·mL－1，规格:每支 0.1 mL。湛江安度斯生物有限公司，批号:1210162，灵敏度:0.03 EU·mL－1，规格:每支0.1 mL)。

细菌内毒素工作标准品(冻干品)(中国食品药品检定研究院，效价:每支100 EU，批号:150601－201176)。细菌内毒素检查用水(福州新北生化工业有限公司，批号:13012115，规格:每瓶50 mL)。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备方法的确立 每片水胶体敷料表面积计为200 cm2，按水胶体敷料表面积每1 cm2加入4 mL细菌内毒素检查用水，37℃保温浸提2 h，为均一透明的溶液，可作为供试品溶液用于正式试验。

2.2 鲎试剂灵敏度复核试验 按《中国药典》2010年版二部附录细菌内毒素检查法对两个厂家的鲎试剂进行灵敏度复核试验，结果见表1。由结果可知，2 λ 管均为阳性，0.25 λ 管和阴性对照管均为阴性，两个不同厂家的3批鲎试剂灵敏度测定值均在0.5～2.0 λ范围内，符合要求，可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验结果

2.3 内毒素限值(L)的确定 水胶体敷料的通常临床用量为每次1片(每片表面积为200 cm2)，根据公式 L=K/M，注射剂 K=5 EU·kg－1·h－1，式中M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，人均体重按 60 kg计算，则水胶体敷料 L=1.5 EU·cm－2。同时考虑安全系数为3的情况下，最终确定限值(L)为 1/3 ×1.5 EU·cm－2=0.5 EU·cm－2。

2.4 干扰试验预试验 目前市售鲎试剂λ通常在0.5 ～0.03 EU·mL－1，根据公式 MVD=cL/λ，式中L为供试品的细菌内毒素限值，c为供试品溶液的浓度，λ为鲎试剂的标示灵敏度，则水胶体敷料供试品溶液对应的最大有效稀释倍数分别为1、2、4倍。取水胶体敷料样品一批(批号:130220)，将水胶体敷料浸提液用细菌内毒素检查用水分别配制成为1、2、4倍稀释液，将此系列溶液记为NPC。同法制备上述系列溶液，向其中加入内毒素标准溶液，使每一浓度的溶液中均含有2 λ浓度的细菌内毒素，此系列溶液记为PPC。取湛江安度斯生物有限公司和湛江博康海洋生物有限公司生产的灵敏度均为0.125 EU·mL－1鲎试剂，分别与上述NPC和 PPC进行反应，每一浓度重复做2管，同时设阳性对照(PC)和阴性对照(NC)，干扰预试验结果见表2。预试验结果表明，本试验条件下制备的水胶体敷料供试品溶液可能对细菌内毒素检查无干扰作用。

表2 水胶体敷料供试品溶液干扰试验预试结果

2.5 干扰试验 为了最终确认是否存在干扰因素的影响，取“2.1”项下水胶体敷料样品(批号:130220)制备的供试品溶液一批，按《中国药典》2010年版二部附录ⅪE“细菌内毒素检查法”凝胶法干扰试验项进行正式干扰试验，结果见表3。正式干扰试验结果表明，采用湛江安度斯生物有限公司和湛江博康海洋生物有限公司生产的灵敏度均为0.125 EU·mL－1的鲎试剂进行试验，Es均在0.5～2.0 λ 内且 Et/Es均在 0.5 ～2.0 λ 之间，确认水胶体敷料供试品溶液对细菌内毒素检查无干扰。

2.6 质量标准起草 取本品适量，以水胶体敷料表面积每1 cm2加入4 mL细菌内毒素检查用水的比例，37 ℃保温浸提 2 h，按 GB/T14233.2—2005中的细菌内毒素试验进行，每1 cm2中含内毒素的量应小于0.5 EU。

表3 水胶体敷料供试品溶液的干扰试验结果

2.7 样品细菌内毒素检查 根据“2.5”项下结果，取3批样品，分别用两个不同厂家灵敏度为0.125 EU·mL－1的鲎试剂按本试验起草的标准和《中国药典》2010年版二部附录ⅪE“细菌内毒素检查法”凝胶限度试验对样品进行细菌内毒素检查，结果见表4。结果表明3批样品的细菌内毒素检查结果均符合起草的质量标准要求。

表4 水胶体敷料样品细菌内毒素检查结果

2.8 样品细菌内毒素的凝胶半定量检测 用灵敏度为0.03 EU·mL－1的鲎试剂对水胶体敷料供试品溶液作细菌内毒素检查，则最大有效稀释倍数为4。用细菌内毒素检查用水将3批供试品溶液分别作1、2、4倍稀释(NPC)，按《中国药典》2010年版二部附录的凝胶半定量试验进行，同时制备供试品阳性对照PPC(添加内毒素使其含外加内毒素为0.06 EU·mL－1)。分别取上述溶液0.1 mL，加到预先加有0.1 mL鲎试剂的反应管内，每个浓度做2管，混合均匀，同时设阳性对照和阴性对照，结果见表5。结果表明，3批样品的细菌内毒素含量均在每片25～50 EU之间。

3 讨论

随着对伤口愈合认识的深入，薄膜类、泡沫类、水凝胶类、水胶体类、藻酸盐类、药用类等一系列医用新型敷料不断涌现。2000年8月美国食品药品管理局(FDA)在新颁布的创面医疗用品(外用药和敷料)行业指南中特别强调，保持创面的湿润环境是标准的处理方法，新型密闭性敷料逐渐成为医用敷料发展的主流。水胶体敷料由水状胶粘剂、覆盖层薄膜和粘结剂组成，主要用于慢性伤口(如压疮)和静脉溃疡伤口的治疗，也可用于急性伤口的护理并且还是一种适用于儿童使用的理想敷料。本文对水胶体敷料应用鲎试剂进行细菌内毒素检查的可行性进行了研究，以期采用细菌内毒素检查法控制本品的致热物质。

供试品溶液的制备是本试验的一个重要环节。供试品浸提时间不得少于1 h，但浸提时间过长，浸提液会变得黏稠，干扰凝胶法测定。浸提时间定为2 h较为合适。每片水胶体敷料表面积为200 cm2，经预试验发现，按水胶体敷料表面积每1 cm2加入2 mL细菌内毒素检查用水，37℃保温浸提2 h，有轻微浑浊现象。按水胶体敷料表面积每1 cm2加入4 mL细菌内毒素检查用水，37℃保温浸提2 h，则为均一透明的溶液。

根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪE“细菌内毒素检查法”和GB/T14233.2—2005中的细菌内毒素试验以及水胶体敷料的临床实际应用情况，确定该品种细菌内毒素检查限值为0.5 EU·cm－2。由于细菌内毒素检查法限值计算采用的是每小时最大可接受的静脉注射内毒素剂量，而本品临床使用途径为体表小伤口的覆盖，其限值不如静脉注射剂要求严格，并同时考虑到安全系数为3，因此采用0.5 EU·cm－2作为本品细菌内毒素检查限值是可以保证临床使用安全的。不同厂家的鲎试剂在工艺、质量等方面有一定差异，其抗干扰能力也存在差异，通过采用2个不同厂家的鲎试剂进行试验，可客观地评价供试品溶液对鲎试剂与内毒素发生凝集反应的干扰程度。经干扰试验确证，在本实验条件下，水胶体敷料浸提液(按水胶体敷料表面积每1 cm2加入4 mL细菌内毒素检查用水，37℃保温2 h)对细菌内毒素检查无干扰作用，可选择灵敏度为0.125 EU·mL－1及以上的鲎试剂对本品进行细菌内毒素检查。按拟定标准检验，本品3批样品的细菌内毒素检查结果均符合起草的质量标准要求，凝胶半定量试验结果表明3批样品的细菌内毒素含量均在每片25～50 EU之间，用细菌内毒素检查法来检测该产品中的致热原是可行的。

表5 水胶体敷料样品凝胶半定量试验结果

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