梅毒螺旋体重组蛋白Tp0965的表达与鉴定

周秀萍　杨长顺　牛淑会　李树平　阳大庆　付祥　曾铁兵

【摘要】 目的：研究梅毒螺旋体（Tp）重组蛋白Tp0965（rTp0965）的表达并鉴定其免疫反应性，为进一步探讨其在梅毒血清学诊断与疫苗中的应用价值奠定基础。方法：构建Tp0965原核表达重组体pET-28a（+）/Tp0965，诱导转化宿主菌表达重组蛋白，Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白，Western blot鉴定其免疫反应性。结果：成功构建了原核表达重组体pET-28a（+）/Tp0965，经诱导高效表达了一分子量约为43 KDa的可溶性重组蛋白，纯化蛋白纯度>95%；Western blot显示该纯化蛋白能被梅毒患者血清特异性识别。结论：高效表达了可溶性rTp0965，该重组抗原有良好的免疫反应性。

【关键词】 梅毒； 梅毒螺旋体； Tp0965； 重组抗原

近几年我国梅毒发病率已居各类性传播疾病（STDs）首位，尤其是胎传梅毒和男-男同性伴艾滋病性梅毒呈显著上升趋势[1-2]。早期诊断和研发有效疫苗对防治梅毒具有重要意义。随着梅毒螺旋体（Treponema pallidum，Tp）全基因组的解析，一些具有诊断和免疫保护价值的重组抗原陆续被表达和评价，然而迄今未发现能检测出临床各期梅毒的抗体的诊断抗原和能诱导完全保护作用的疫苗分子[3-7]。Tp0965是近年来发现的一种假想蛋白，其天然蛋白与梅毒患者血清有较好的免疫反应性，具有潜在的免疫诊断和免疫保护价值[8-9]。本研究克隆表达了Tp0965并鉴定其免疫反应性，为深入评价其免疫诊断和保护作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 菌株和质粒 Tp（Nichols）梅毒菌株、pET-28a（+）质粒及宿主菌均为南华大学病原生物学研究所保存。

1.1.2 试剂和试剂盒 基因组DNA纯化提取试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit）、Ni-NTA亲和层析柱为德国Qiegen公司产品；限制性核酸内切酶NdeⅠ和BamHⅠ、T4连接酶为NEB（北京）有限公司产品；PCR产物回收试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒为美国AxyPrep公司产品；DNA分子量标准、蛋白质分子量标准购自天根生化科技（北京）有限公司；HRP标记羊抗人IgG（二抗）、DNA高保真聚合酶为大连宝生物公司产品；增强化学发光法（ECL）蛋白印迹法检测试剂盒为PIERCE公司产品。

1.1.3 临床血清 梅毒阳性血清（经TPPA确诊梅毒患者血清）、梅毒阴性血清（健康人血清）由怀化第一人民医院检验科提供。

1.2 方法

1.2.1 Tp0965基因扩增 从GenBank获取Tp0965基因序列，设计引物：上游引物F：GGAA TTC CAT ATG ATG ACC ACA GCA CAG AAA CT（斜体为NdeⅠ酶切位点序列）、下游引物R：CG GGA TCC TTT CCT CGC TGC ACT TTG G（斜体为BamHⅠ酶切位点序列）。按说明书以基因组DNA纯化提取试剂盒提取Tp基因组DNA，以其为模板，PCR扩增Tp0965全长基因。PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5 ?L、50 fmol/L引物各0.125 ?L、2.5 mmol/L dNTPs、DNA高保真聚合酶0.5 U、模板1 ?L，加水至25 ?L。扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s、64 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃再延伸10 min。试剂盒回收PCR扩增产物。

1.2.2 重组表达质粒构建与鉴定 分别以NdeⅠ和BamHⅠ双酶切PCR扩增产物与质粒pET-28a（+）、纯化，T4连接酶连接。将构建的pET-28a（+）/Tp0965转化E.coli BL21（DE3），筛选阳性克隆，经酶切及测序（上海Invitrogen公司）鉴定，获得重组工程菌。

1.2.3 诱导表达 重组菌接种于LB培养基培养，30 ℃下以终浓度1.0 mmol/L IPTG诱导表达4 h。煮沸法提取全菌蛋白，SDS-PAGE分析条带中目的蛋白的相对含量。

1.2.4 重组蛋白表达形式鉴定 冰浴超声细菌裂解液裂解的破碎菌体，差速离心以去除残留全菌，4 ℃、14 000 rpm离心20 min，收集上清和沉淀（包涵体），SDS-PAGE分析蛋白表达形式。

1.2.5 重组蛋白纯化 最佳优化条件下大量诱导表达重组菌，裂解菌体经超声破碎，离心收集上清，经Ni-NTA 亲和层析柱纯化，再经SDS-PAGE，UVP扫描分析蛋白纯度。

1.2.6 重组蛋白免疫反应性鉴定 纯化蛋白经电泳后转印至硝酸纤维素（NC）膜，以1：100稀释的10份混合梅毒阳性血清或健康血清（阴性对照）为一抗，以1：10 000稀释的HRP标记羊抗人IgG为二抗进行Western blot，ECL显影，鉴定重组蛋白免疫反应性。

2 结果

2.1 Tp基因PCR扩增 PCR扩增所得目的基因得到长度约为960 bp大小片段，与预期目的片段大小相符。

2.2 重组表达质粒构建与鉴定 重组表达质粒经双酶切鉴定（图1）和DNA测序（与GenBank上登录基因序列完全一致）鉴定，表明pET-28a（+）/Tp0965表达质粒构建成功。

2.3 重组蛋白的诱导表达、表达形式及纯化 诱导表达的菌体蛋白经SDS-PAGE电泳，在约43 KDa处可见一明显条带，与预期分子量大小一致，重组蛋白主要以可溶性形式存在，纯化的重组蛋白经SDS-PAGE显示出单一清晰条带（图2），UVP扫描显示其纯度达到95%以上。

2.4 重组抗原的免疫反应性鉴定 Western blot结果显示，重组蛋白仅被梅毒患者混合血清识别，而不能被健康人血清识别（图3），表明表达产物有良好的免疫反应性和特异性。endprint