低温和干旱胁迫对结缕草游离氨基酸含量的影响

胡立群，徐庆国*，胡龙兴，傅金民*

(1湖南农业大学农学院，长沙410128;2中国科学院武汉植物园，武汉430074)

结缕草是世界多个国家和我国的一种重要暖季型草坪草种质资源，它具有发达的匍匐茎和地下根状茎，繁殖能力强，并且，还具有植株密度大、耐践踏、再生性强、质地优良、成坪较快、抗性强等优点，因而广泛应用于运动场和园林绿化草坪。目前国内外城市普遍面临水资源供给短缺问题，草坪节水已经成为草坪业亟待解决的课题。同时我国长江中下游广大地区具有冬冷夏热、四季温差较大的气候特点，如何提高暖季型草坪草的抗寒性，延长其绿色期，也越来越受到人们关注。要解决结缕草应用中的节水与耐寒问题，通过选育抗旱性与抗寒性强的结缕草新品种无疑是一种很好的方法。

氨基酸是构成蛋白质的基本单元，种类繁多，目前从生物体内已检测出的氨基酸多达180余种［1］。氨基酸与结缕草抗逆性密切相关。前人研究发现，结缕草在干旱胁迫下会积累脯氨酸［2～4］。对结缕草低温胁迫生理变化的研究表明，低温胁迫下的结缕草脯氨酸含量均表现积累趋势［5～7］。但是，目前对于结缕草逆境条件下氨基酸代谢的生理响应研究多局限于脯氨酸的渗透调节作用，对于其它氨基酸则较少涉及。本研究利用气相色谱—质谱联用仪(GC－MS)，测定野生结缕草品系WZG43和WZG133在低温和干旱胁迫下多种游离氨基酸含量变化，以便更深入了解结缕草的氨基酸逆境响应机制，为培育抗寒性和抗旱性强的结缕草新品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与培养方法

本研究供试材料来源于中国科学院武汉植物园草坪种质资源组从全国各地收集的野生草坪草苗圃。2013年3月下旬从苗圃中挑选出2份原生境不同的野生结缕草，分别为WZG43与WZG133，然后置于直径15 cm的塑料盆中培养(目的是将结缕草试验材料从匍匐茎状态培养成直立茎，以便于后续试验的开展)，盆内栽培基质为1∶1的河沙与泥炭土混合物。培养环境为封闭式玻璃温室，培养期间每2 d浇水一次，每10 d浇一次Hoagland营养液，视材料生长状况对其进行修剪以促进分蘖，确保得到足够多的试验材料。供试材料的原生境情况如表1。

表1 供试结缕草材料的原生境情况Table 1 The original habitat conditions of tested Zoysia materials

1.2 胁迫处理方法

2013年6月7日将塑料盆中培养的供试结缕草取出，用水将根部泥土洗净，然后将根部置于用锡箔纸完全包裹(防止瓶内Hoagland营养液中绿藻疯长从而影响对结缕草的养料供给)的锥形瓶内，瓶内的培养基质为1/2Hoagland营养液。瓶口用保鲜膜包裹的卫生纸条密封，以保证瓶内有足够的空气进入且最大限度减少瓶内水分的损失。每种结缕草各培养18瓶，共计36瓶。

供试结缕草于锥形瓶中培养15 d后，各挑选出适应营养液培养较好的6瓶，于2013年6月21日开始进行胁迫处理。每种材料分干旱、低温两种胁迫处理方式。其中干旱胁迫处理采用1/2 Hoagland营养液配制质量分数为20%PEG的溶液模拟，并将干旱胁迫材料置于人工气候箱内。气候箱温度与光照设置分别为昼/夜:28/25℃、14/10 h。低温胁迫采用温度4±0.5℃的人工气候箱模拟，其光照设置与干旱胁迫一致。各供试结缕草的干旱与低温胁迫处理材料均重复3次，共计12瓶。

1.3 取样方法

分别于胁迫处理第0(对照)、11、19 d各取样一次。取样部位为供试结缕草茎顶端第二至第三片完全展开功能叶，取样植株为随机选取。用万分之一天平准确称取样品质量，取样总质量视具体测定指标而定。各供试结缕草材料的各氨基酸含量均重复取样测定3次，结果取平均值。

1.4 氨基酸测定与数据分析方法

采用GC－MS测定各氨基酸含量，具体步骤如下:

(1)游离氨基酸的提取。将鲜叶样品0.100 g置于研钵中，迅速加入液氮研磨至粉末，将粉末移至2 mL离心管内，加入1.4 mL80%甲醇后于200 r/min、室温下振荡提取2 h;加入20 μL2 mg/L核糖醇和50 μL2 mg/L正十九酸甲脂，涡旋10 s后置于70℃金属浴15 min，期间每5 min涡旋1次;然后于12 000 r/min、20℃下离心5 min。将上述上清液转移至10 mL离心管内，加入750 μL氯仿、1.5 mL超纯水，涡旋 15 s，再于 8 000 r/min、20℃下离心 15 min［8］。

(2)衍生化。取上一步离心好的极性相300 μL置于2 mL进样瓶内，在真空浓缩仪(900 rpm、30℃)中干燥6 h，然后加入80 μL20 mg/mL盐酸甲氧胺，涡旋15 s，于室温、200 r/min震荡2 h;再加入50 μL硅烷化试剂 MSTFA，涡旋15 s，于 37℃、200 r/min震荡 2 h［9］。

(3)初级代谢产物测定。利用 The Agilent 7890A/5975C气相色谱—质谱联用系统进行测定。气相色谱和质谱条件为:载气为氦气(99.999%)，流速1 mL/min，进样不分流模式，进样量1 μL，升温程序为 70℃ 保持 5 min，以 5℃/min速率升至300℃，保持10 min，下次进样前70℃平衡1 min;此外，电子轰击(electron impact)离子源，电子能量70 eV，进样口温度280℃，柱箱温度290℃，离子源温度230℃，扫描速度0.6 scan/s，溶剂延迟时间4 min，质量扫描范围(m/z)为30 ～650［10］。

(4)初级代谢产物鉴定及数据分析。采用Agilent ChemStation 2011版软件以全扫描方式分析代谢产物。软件中选取RTE积分器对各波峰进行智能积分，利用NIST2011代谢谱库鉴定糖类代谢产物，再使用AMDIS GC/MS Analysis 2.70进行杂质及非氨基酸类物质剔除［11］。对各氨基酸导出数据中选取波形积分面积与内标物面积相比，使用Excel 2007对比值进行整理并作图分析，采用SPSS19.0对比值作差异性分析。

2 结果与分析

2.1 结缕草的氨基酸代谢产物鉴定结果

利用GC－MS技术，采用NIST2011代谢谱库及AMDIS GC/MS Analysis 2.70软件，对结缕草叶片的氨基酸代谢产物进行指认，在结缕草 WZG43与WZG133叶片内共检测出14种氨基酸，各氨基酸代谢产物的鉴定结果详见表2。

表2 两种结缕草叶片内氨基酸类代谢产物的鉴定结果Table 2 The identification result on amino acid metabolites in leaves of two lines of Zoysia

2.2 低温与干旱胁迫对结缕草游离氨基酸的影响

本研究结果显示(图1)，结缕草 WZG43和WZG133所含14种游离氨基酸在低温与干旱胁迫条件下的含量均呈不同程度的显著积累趋势，其中各氨基酸含量在干旱胁迫下的积累幅度均显著低于低温胁迫的积累幅度。低温与干旱胁迫前，结缕草WZG43和WZG133叶片内的各氨基酸含量各不相同，其中以天冬酰胺含量最高，异亮氨酸含量最低。WZG43和WZG133的某些氨基酸含量也存在差异，其中WZG43的丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺含量显著小于WZG133的各相应氨基酸含量，而其余氨基酸含量不存在显著差异。

如图1所示，低温与干旱胁迫至11 d时，与胁迫前相比较，结缕草WZG43和WZG133在低温与干旱胁迫下的各氨基酸含量均有不同程度增加，其中，在干旱胁迫下的各氨基酸含量的增加幅度均显著小于低温胁迫下各氨基酸含量的增加幅度。并且，结缕草WZG43和WZG133在低温或干旱相同胁迫条件下的各氨基酸含量也存在明显差异，WZG43干旱胁迫下的异亮氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺含量显著大于WZG133的各相应氨基酸含量;WZG43干旱胁迫下的甘氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸、天冬酰胺含量与WZG133的各相应氨基酸含量无显著差异;WZG43干旱胁迫下的其余氨基酸含量则显著小于WZG133的其余氨基酸含量。低温胁迫下，WZG43的丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸含量显著大于WZG133的各相应氨基酸含量;WZG43和WZG133的天门冬氨酸含量无显著差异;WZG43的其余各氨基酸含量均显著小于WZG133的其余各氨基酸含量。

如图1所示，低温与干旱胁迫至19 d时，与胁迫11 d时相比较，结缕草WZG43和WZG133叶片内各氨基酸含量在干旱胁迫下均显著升高;而低温胁迫下的氨基酸含量变化则表现各异，其中，丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸含量显著下降，其余氨基酸含量变化则表现为无显著差异或者呈显著增加。WZG43和WZG133在低温或者干旱不同胁迫下的各氨基酸含量变化表现各异，其中，WZG133干旱胁迫下的苏氨酸、丙氨酸含量和WZG43的缬氨酸含量显著大于其低温胁迫的各相应氨基酸含量;WZG43和WZG133干旱胁迫下的其余氨基酸含量均显著低于低温胁迫下的其余氨基酸含量。WZG43和WZG133在低温或者干旱相同胁迫下的各氨基酸含量也表现各异，WZG43干旱胁迫下的缬氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺含量显著高于WZG133的各相应氨基酸含量;WZG43和WZG133的谷氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺含量则无显著差异，而WZG133的其余氨基酸含量则均表现为显著高于WZG43的其余氨基酸含量。WZG43低温胁迫下的丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺含量显著大于WZG133的各相应氨基酸含量;WZG43低温胁迫下的其余各氨基酸含量均显著低于WZG133的其余各氨基酸含量。

图1 低温、干旱胁迫下结缕草叶片各氨基酸含量的变化Fig.1 The changes of amino acid content in leaves of Zoysia japonica under drought or cold stress

3 讨论

积累游离氨基酸是植物逆境响应的一种重要方式，大量研究表明，植物在低温或干旱胁迫下其游离氨基酸呈现积累趋势［12～15］。目前对植物氨基酸逆境生理作用多倾向于其渗透调节，其中脯氨酸已经研究得比较清楚［5～7］。植物积累脯氨酸能力与其耐胁迫能力有一定相关关系，这在多年前就已得到证实［16］。本 研 究 结 果 显 示，结 缕 草 WZG43 和WZG133在低温或干旱胁迫下的14种氨基酸含量均有积累趋势，其中低温胁迫诱导的氨基酸积累幅度显著大于干旱胁迫的积累幅度，表明4℃低温胁迫给结缕草带来的伤害远大于20%PEG模拟的干旱胁迫带来的伤害。结缕草WZG43和WZG133在低温与干旱胁迫下的脯氨酸呈现一定程度的积累趋势，其中WZG43低温胁迫下的脯氨酸积累幅度显著高于WZG133的脯氨酸积累幅度，这表明WZG43的耐寒性比WZG133强。

天冬酰胺是第一种从植物体内分离出来的氨基酸，它存在于大多数蛋白质中。胁迫条件下，植物积累脯氨酸的同时，天冬酰胺也得到一定程度积累。Cariloo等［17］研究了盐胁迫对硬粒小麦硝酸还原酶的影响，结果显示天冬酰胺呈现积累态势。Stewart等［18］在论述植物积累氨基酸和相关代谢产物与胁迫环境间的关系时指出，天冬酰胺可能具有脯氨酸类似的逆境调节作用。而Lea等［19］指出，这可能只是从侧面表明逆境抑制了植物体内蛋白质的合成。本研究结果显示，两个结缕草WZG43和WZG133在低温或干旱胁迫下天冬酰胺含量均呈显著积累趋势，其中低温胁迫下天冬酰胺含量的积累幅度显著高于干旱胁迫的积累幅度，表明结缕草响应低温或干旱胁迫的重要策略是积累天冬酰胺，以此进行渗透调节，并进一步说明了低温胁迫比干旱胁迫对结缕草可能造成了更大的损伤。

［1］王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学(第三版)［M］.北京:高等教育出版社，2002.

［2］胡化广，张振铭，黄亮亮.结缕草对干旱胁迫的响应［J］. 草原与草坪，2008(3):41－44.

［3］赵 艳，孙吉雄，王兆龙.不同抗旱性结缕草品种在土壤干旱及复水过程中的生理差异［J］.草原与草坪，2008(6):46－48.

［4］周兴元，曹福亮，刘国华.两种暖季型草坪禾草对土壤持续干旱胁迫的生理反应［J］.草业学报，2004，13(1):84－88.

［5］黄锦文，陈冬梅，郑红艳，等.暖季型结缕草对低温响应的生理生态特性［J］.中国草地学报，2009，31(1):64－69.

［6］刘 颖，沈益新，顾洪如，等.两种结缕草品系对低温胁迫的生理响应研究［J］.草地学报，2010，18(2):228－232.

［7］杜永吉，于 磊，鲁为华，等.结缕草品种抗寒性和抗寒机理研究［J］. 草地学报，2008，16(4):347－352.

［8］Barnett NM，Naylor AW.Amino acid and protein metabolism in Bermude grass during water stress ［J］.Plant Physiology，1966，41(7):1222 －1230.

［9］Rizhsky L，Liang HJ，Shuman J，et al.When defense pathways collide.The response of Arabidopsis to a combination of drought an heat stress［J］.Plant Physiol，2004，134(4):1683－1696.

［10］Danial JC.Development，optimization and validation of targeted and global metabolite profiling strategies for probing plant metabolism ［D］.Washington:Washington State University，2011.

［11］Qiu Y，Su M，Chen M.Application of ethyl chloroformate derivatization for gas chromatogram－phymass spectrometry based metabonomic profiling［J］.Anal Chim Acta，2007，538(2):277 －283

［12］Fatma K，Joachim K，Dong YS，et al.Transcript and metabolite profiling during cold acclimation of Arabidopsis reveals an intricate relationship of cold－regulated gene expression with modifications in metabolite content［J］.Plant Journal，2007，50(6):967 －981.

［13］Groppa MD，Benavides MP.Polyamines and abiotic stress:recent advances［J］.Amino Acid，2008，34(1):35－45.

［14］Urano K，Maruyama K，Ogata Y，et al.Characterization of the ABA－regulated global responses to dehydration in Arabidopsis by metabolomics［J］.Plant Journal，2009，57(6):1065－1078.

［15］Kovacs Z，Simon － Sarkadi L，Szucs A，et al.Differential effects of cold，osmotic stress and abscisic acid on polyamine accumulation in wheat［J］.Amino Acid，2010，38(2):623－631.

［16］Barnett NM，Naylor AW.Amino acid and protein metabolism in Bermude grass during water stress［J］.Plant Physiology，1966，41(7):1222 －1230.

［17］Cariloo P，Mastrolonardo G，Nacca F，et al.Nitrate reductase in durum wheat seedling as a affected by nitrate nutrition and salinity［J］.Functional Plant Biology，2005，32(3):209－219.

［18］Stewart GR，Larher F.Accumulation of amino acids and related compounds in relation to environmental stress［J］.In The Biochemistry of Plants，1980(5):609 －635.

［19］Lea PJ，Sodek L，Parry MA，et al.Asparagine in plants［J］.Annals of Applied Biology，2007，150(1):1 －26.