白癜风自体培养黑素细胞移植疗效与白细胞介素17、Foxp3的相关性研究

李晓文 林福全 张迪敏 洪为松 许爱娥

白癜风自体培养黑素细胞移植疗效与白细胞介素17、Foxp3的相关性研究

李晓文 林福全 张迪敏 洪为松 许爱娥

目的探讨白癜风自体培养黑素细胞移植疗效与白细胞介素17、Foxp3的相关性。方法对40例稳定期寻常型白癜风患者进行自体培养黑素细胞移植,同时收集其外周血,6个月后根据移植效果将收集的血液分为成功组25例,失败组15例。用ELISA的方法测定移植成功与移植失败外周血中白细胞介素17及Foxp3水平,比较移植成功组与失败组血清中白细胞介素17及Foxp3水平的差异。用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。结果移植成功组血清中白细胞介素17(15.29±7.86)ng/L,明显低于移植失败组(43.88± 13.02)ng/L,差异有统计学意义。血清中Foxp3的水平,移植成功组(6.08±2.03)ng/L,高于移植失败组(3.37± 1.81)ng/L,两者之间比较,差异有统计学意义。结论血清白细胞介素17水平升高、Foxp3水平降低与白癜风患者的移植失败有相关性。

白癜风;白细胞介素17;Foxp3;细胞移植;移植,自体;治疗结果

白癜风是一种与自身免疫相关的色素脱失性疾病,其发病机制尚未明确,白癜风患者血清和组织内发现有大量细胞因子异常分泌[1-3],如:白细胞介素(IL)10、IL-13、IL-17A等。自体培养黑素细胞移植是近几年来治疗稳定期白癜风的一种有效的方法,我院[4]采用自体培养的黑素细胞移植治疗了632例患者(最大面积达640 cm2),总有效率为82.28%,痊愈率为52.85%,但仍有部分患者移植效果不佳,可能与细胞因子介导的免疫异常有关[5]。我们从细胞因子IL-17与Foxp3水平研究其与移植疗效的相关性。

一、资料与方法

1.临床资料:40例寻常型稳定期白癜风患者均来自本院皮肤科门诊。其中男18例,女22例,年龄10～68岁,平均29岁,病程1～30年,平均7.9年,所有患者的诊断与分型均符合文献[6],且均为寻常型,稳定时间≥6个月。移植部位位于面颈部21例、躯干部11例、四肢部8例,移植后6个月观察疗效,我们将复色面积≥70%定义为移植成功组,将复色面积≤20%定义为移植失败组,所有患者均非节段型白癜风,无甲状腺等其他自身免疫性疾病及严重系统性疾病。本研究通过本院伦理委员会批准,移植治疗的患者均签署知情同意书。

2.标本采集:患者移植当日于晨8时空腹采集外周静脉血5 ml,静置1 h后以1 157×g离心,20 min后取上清液装于微量离心管中,封口储存在-80℃冰箱内备检。6个月后,根据随访情况将其纳入移植成功组或移植失败组。

3.自体培养的黑素细胞移植:将虹膜剪剪下的供皮区正常皮肤置于无菌D-Hanks液中,用0.25%胰蛋白酶及0.02% EDTA先后在37℃消化10 min。在立体显微镜下刮下角质层下及真皮上的细胞。用D-Hanks液冲洗后以半径5 cm, 129×g,离心5 min,收集沉淀细胞重悬浮于黑素细胞Hul6选择性培养基(F12基础培养基,含bFGF、CT、IBMX和胎牛血清)中,并将细胞团吹打成细胞悬液,调整细胞浓度5× 105/ml接种于培养瓶中,置37℃、5%CO2培养箱内培养。在第3天加入基因素(100 μg/m1)以去除角质形成细胞和成纤维细胞的污染,隔天换液1次。当黑素细胞融合后,用0.05%胰酶-EDTA将黑素细胞从培养瓶上消化下来进行传代培养。当细胞数量达到最优接种量[4]时,将黑素细胞从培养瓶上消化下来,离心收集黑素细胞悬浮于F12培养基中备用。用CO2激光磨削掉利多卡因局部麻醉后的受皮区,根据移植白斑区的面积,按600～1 000个细胞/mm2[7]收集黑素细胞,用巴氏吸管将细胞悬液均匀地接种在移植区。无菌凡士林纱布覆盖,外敷含F12培养液湿纱布,包扎固定。嘱咐患者平卧休息1 h,7～10 d后去除纱布,6个月后观察移植疗效。

4.检测方法:人IL-17试剂盒购自美国RD公司,Foxp3 (Human forhead box P3)试剂盒购自美国Mybiosource公司,用ELISA法检测。操作步骤按照试剂盒说明书进行。根据标准曲线和直线回归方程式,计算IL-17、Foxp3浓度。

5.统计分析:使用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。计量资料用±s表示,两组间样本均数比较用独立样本t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.临床资料比较:移植成功组25例,其中男10例,女15例,平均年龄(28.92±11.25)岁,病程(7.8±7.11)年,白斑稳定时间(14.76±12.04)个月,移植面积(42.08±34.83)cm2,平均复色率为88%;移植失败组15例,其中男8例,女7例,平均年龄(30.33±13.81)岁,病程(8.06±5.92)年,白斑稳定时间(13.33±4.60)个月,平均移植面积(37.66±20.77),移植成功组与失败组在性别、年龄、病程、稳定时间及移植面积方面相匹配,具有可比性。

2.白癜风患者外周血中IL-7、Foxp3的检测:移植成功组血清中IL-17(15.29±7.86)ng/L、失败组(43.88±13.02)ng/L,移植成功组明显低于移植失败组,两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。血清中Foxp3的水平,成功组(6.08±2.03)ng/L,失败组(3.37±1.81)ng/L,移植成功组明显高于移植失败组(P＜0.05),两者之间差异有统计学意义。见表1。

表1 白癜风移植成功组与移植失败组外周血IL-17、Foxp3的检测(±s) ng/L

表1 白癜风移植成功组与移植失败组外周血IL-17、Foxp3的检测(±s) ng/L

注:两组比较,P＜0.01

组别 例数 IL-17 Foxp3成功组 25 15.29±7.86 6.08±2.03失败组 15 43.88±13.02 3.37±1.81 t值 7.70 4.32 P值 0.01 0.01

三、讨论

自体黑素细胞移植是一种治疗白癜风的有效方法,适用于传统方法治疗无效的稳定期白癜风。虽然使用个体化培养基进行自体黑素细胞培养使移植效果明显提高[8],但仍有部分患者移植失败或效果不佳,可能与寻常型稳定期白癜风患者局部白斑皮肤处于免疫异常状态[9]相关。我们的实验发现,在移植成功与移植失败的白癜风外周血中,移植成功组血清中的IL-17水平明显低于移植失败组,且差异有统计学意义(P＜0.05)。IL-17被认为是Th-17细胞产生的最主要的细胞因子,有促炎症和机体防御功能[10]。有研究表明,IL-17在白癜风患者皮损处组织液中的表达水平升高[9-10]。Bassiouny等[2]报道,白癜风患者血清及组织中的IL-17水平均较正常对照组高,说明黑素细胞处于破坏阶段。与此同时,我们还发现在移植成功与移植失败的白癜风外周血中,Foxp3+的水平显著高于移植失败组,差异有统计学意义(P＜0.05)。

我们的研究表明,移植失败组血清中的IL-17表达增高,而Foxp3水平下降,我们推测移植失败的原因可能是:一方面Th17介导的炎症反应亢进,过度及持续表达的IL-17可能通过刺激炎症细胞产生IFN-r,IL-6,IL-8等炎症因子而对黑素细胞产生损伤,从而导致移植部位黑素细胞的凋亡。另一方面是Treg细胞免疫抑制功能的降低,Foxp3+水平的降低使Treg细胞的免疫抑制功能降低,不能抑制自身反应性T细胞的活化,导致自身炎症反应的持续存在,从而使黑素细胞受损,导致移植效果不佳。导致IL-17及Foxp3失衡的诱因尚不清楚。由于我们的样本量较小,还需要更多的研究。

[1]Tembhre MK，Sharma VK，Sharma A，et al.T helper and regulatory T cell cytokine profile in active，stable and narrow band ultraviolet B treated generalized vitiligo[J].Clin Chim Acta，2013，424:27-32.

[2]Bassiouny DA，Shaker O.Role of interleukin-17 in the pathogenesis of vitiligo[J].Clin Exp Dermatol，2011，36(3):292-297.

[3]李廷慧，侯晓彬，肖漓，等.CD4+CD25+调节性T细胞与Foxp3表达在白癜风发病中的作用[J].中国美容医学，2009，6(18): 819-822.

[4]洪为松，傅丽芳，尉晓东，等.自体黑素细胞移植治疗白癜风细胞接种量与疗效关系研究[J].中华皮肤科杂志，2013，46(4): 235-238.

[5]Wu J，Zhou M，Wan Y，et al.CD8+T cells from vitiligo perilesional margins induce autologous melanocyte apoptosis[J].Mol Med Rep，2013，7(1):237-241.

[6]中西医结合学会皮肤病专业委员会色素病学组.白癜风临床诊断分型与疗效标准(2003年修订稿)[J].中华皮肤科杂志，2004，37(7):440.

[7]Hong WS，Hu DN，Qian GP，et al.Treatment of vitiligo in children and adolescents by autologous cultured pure melanocytes transplantation with comparison of efficacy to results in adults [J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2011，25(5):538-543.

[8]张迪敏，洪为松，傅丽芳，等.个体化培养自体黑素细胞移植治疗白癜风[J].中华皮肤科学杂志，2010，43(10):721-725.

[9]宋秀祖，许爱娥，宋秀芬.白癜风患者调节性T细胞及单核细胞趋化蛋白-1及可溶性细胞间黏附分子-1的检测[J].中华皮肤科杂志，2006，39(2):95-97.

[10]Shen F，Gaffen SL.Structure-function relationships in the IL-17 receptor:implications for signal transduction and therapy[J]. Cytokine，2008，41(2):92-104.

2013-12-04)

(本文编辑:吴晓初)

Relationship between the efficacy of autologous cultured melanocyte transplantation and serum levels of interleukin-17 and FoxP3 in patients with vitiligo

Li Xiaowen，Lin Fuquan，Zhang Dimin，Hong Weisong，Xu Ai′e.Department of Dermatology，Third People′s Hospital of Hangzhou，Hangzhou 310009，China

Xu Ai′e，Email:xuaiehz@msn.com

ObjectiveTo investigate the relationship between the efficacy of autologous cultured melanocyte transplantation and serum levels of interleukin-17(IL-17)and FoxP3 in patients with vitiligo.MethodsForty patients with stable vitiligo vulgaris were included in this study，and

autologous cultured melanocyte transplantation.Six months after the transplantation，treatment efficacy was evaluated，and patients were classified into the successfully treated group(n=25)and unsuccessfully treated group(n=15).Peripheral blood was collected from all the patients before the transplantation，and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed to measure the serum levels of IL-17 and FoxP3.Statistical analysis was done using two independent samplest-test with the SPSS software(version 17.0).ResultsThe successfully treated patients showed lower serum levels of IL-17((15.29±7.86)vs.(43.88±13.02)ng/L，P＜0.05)，but higher serum levels of FoxP3 ((6.08±2.03)vs.(3.37±1.81)ng/L，P＜0.05)than the unsuccessfully treated patients.ConclusionThe increased serum IL-17 and decreased serum FoxP3 may contribute to the failure of autologous cultured melanocyte transplantation in patients with vitiligo.

Vitiligo;Interleukin-17;Forhead box P3;Cell transplantation;Transplantation，autologous; Treatment outcome

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.016

国家自然科学基金(81071294、81271758);浙江省自然科学基金(z2100973);省部共建项目(WKJ2012-2-036);杭州市重大科技创新项目(20122513A02)

310009杭州市第三人民医院皮肤科

许爱娥,Email:xuaiehz@msn.com