凝集生长毛乳头细胞分泌性蛋白组的初步分析

夏汝山 顾静 陶诗沁 杨莉佳

凝集生长毛乳头细胞分泌性蛋白组的初步分析

夏汝山 顾静 陶诗沁 杨莉佳

目的了解毛乳头细胞在凝集生长状态下分泌性蛋白组的表达。方法以凝集和非凝集生长的毛乳头细胞为研究对象,分别制备分泌性蛋白质,以双向凝胶电泳技术和PDQuest软件分析二者之间的蛋白图谱的差异,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MLDI-TOF-MS)鉴定表达差异的蛋白质,通过蛋白质数据库NCBInr检索分析。结果建立了重复性好、分辨率高的双向电泳图谱;在凝集生长和非凝集生长的毛乳头细胞分泌性蛋白质中分别检测到(1 134±52)个和(1 078±36)个蛋白点,大多匹配。按照差异量在5倍以上的标准,二者存在差异蛋白质28个,经过MLDI-TOF-MS质谱鉴定出10种差异表达蛋白点,其中8种蛋白质表达上调,分别为Rho GDP分离抑制剂1、细丝蛋白A、胱抑素C、纤维连接蛋白、亲环素A、前胶原C端蛋白酶增强子、组织金属蛋白酶抑制剂、组织金属蛋白酶-2抑制剂。2种蛋白质表达下调,为神经肽h3和基质金属蛋白酶-3金属蛋白酶组织抑制剂-1复合物复合物。结论凝集生长和非凝集生长毛乳头细胞差异蛋白主要涉及信号通路、细胞增殖与分化、细胞外基质合成及降解等功能。

毛乳头细胞;分泌蛋白质类;电泳,凝胶,双向;MALDI-TOF质谱

毛乳头是毛囊的真皮部分,体外培养时呈凝集性生长为其特性之一,有诱导毛囊形成和再生的能力。随着细胞传代至第6～15代时,毛乳头细胞(dermal papilla cells，DPC)失去凝集性生长特性并失去诱导毛囊形成和毛囊再生的能力。研究证实,凝集生长的DPC分泌大量蛋白样因子,共同调节其他DPC、外根鞘细胞和角质形成细胞的增殖[1]。研究这些蛋白质,对于阐明毛囊周期调控,解决脱发问题具有一定的价值。然而,这些有重要功能的蛋白质大多是低丰度蛋白质,由于含量少,样品制备成为实验的关键。在前期[2]工作中,我们建立了制备DPC分泌性蛋白质组方法。在本研究中,我们通过蛋白质组学比较凝集与非凝集生长DPC的蛋白表达差异,探讨DPC凝集生长的生理基础。

材料与方法

一、材料

1.试剂及仪器:DMEM培养基为美国Hyclone公司产品;IPG胶条(pH3～10,13 cm)、IPG缓冲液、DTT、碘乙酰胺、CHAPS、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris为美国Amersham Pharmacia产品;三氟乙酸、胰蛋白酶为美国Sigma产品。硝酸银为国产试剂。双向电泳模具、IPGPhorⅡ型等电聚焦仪和SE600电泳仪为美国Amersham Pharmacia公司产品;凝胶扫描仪为美国Bio-Rad公司产品;MALDITOF质谱仪为德国Burker公司产品。

2.标本:所需毛乳头来自门诊外科头皮术后残留的含毛发正常组织。经无锡市第二人民医院伦理委员会批准,患者均签署知情同意书。

二、方法

1.细胞培养:采用“二步酶”法分离和培养人头皮毛乳头,DPC在常规条件下扩大培养,培养第3代以前为凝集性生长DPC,第6代以后为非凝集性生长DPC(图1)。细胞生长至80%融合时,用0.1 mol/L PBS洗涤3次,加入适量Williams E无血清培养基,孵育24 h后收集无血清培养上清,在4℃低温、1 699×g条件下离心1 h,收集上清液。

2.蛋白质样品制备:DPC分泌性蛋白质制备,参照已建立的方法[2]。

3.双向电泳及图像分析:双向电泳参照Görg等[3]描述的方法,150 μg总蛋白与重水化液(8 mol/L尿素,2%CHAPS,60 mmol/L DTT和0.5%IPG缓冲液pH 3～10)混合,总体积250 μl吸入IPG胶槽,置于IPGphor等电聚焦仪电极板上,重水化和等电聚焦在20℃自动进行,总电压时间积40 000 Vh。等电聚焦后于平衡液中平衡2次。SDS-PAGE在SE600电泳仪中进行。电泳结束后,用质谱兼容的银染法染色,超纯水脱色至背景清楚。用Gel Doc 2000成像系统对凝胶进行扫描,图像经PDQuest分析软件进行处理并比较差异蛋白质点。

4.肽质量指纹谱(PMF)鉴定:选取差异5倍以上的蛋白点,从凝胶上准确切割后用水清洗几次后用含50%乙腈,25 mmol/L NH4HCO3溶液浸泡胶片,至胶片中蓝色褪尽;真空离心干燥使胶片完全脱水,加入0.01 μg/μl的胰酶溶液5～10 μl,待酶液完全吸收后补充10 μl 25 mmol/L NH4HCO3,37℃保温15 h;加5%三氟乙酸50～100 μl于40℃保温1 h,吸出上清,加入2.5%三氟乙酸,50%乙腈50～100 μl于30℃保温1 h,吸出上清,合并上清液,冷冻干燥。制备好的样品置于质谱仪上进行分析,采用线性模式、正离子谱测定,离子源加速电压1为20 kV,加速电压2为18.85 kV,N2激光波长337 nm,脉冲宽度为3 ns,离子延迟提取500 ns,真空度4× 10-7Torr,质谱信号单次扫描累加50次,并用基质峰和胰蛋白酶自动降解离子峰为内标校正质谱峰,获得PMF。

5.数据库查询:通过中国国家生物医学中心的蛋白质组学网站(www.proteomics.com.cn),Mascot网站(http://www.matrixscience.com/)查询。

6.统计学分析:双向电泳实验重复3次,电泳图谱经PDQuest软件分析,蛋白点数以±s表示。MASCOT是数据库检索软件,质谱分析中以MASCOT评分作为一个直观的数值来评价一个结果是否可信,Mascot分数高低取决于数据库的大小与设定的P值,我们以MASCOT评分＞65,P＜0.05认定结果可信,以得分最高的蛋白作为匹配蛋白。

结果

一、凝集与非凝集性生长毛乳头细胞生长特征

低传代DPC呈现凝集性生长特征(图1a),第6代后的DPC呈梭形,表现为成纤维细胞形态,不出现凝集性生长特征,为非凝集性生长DPC(图1b)。

图1 毛乳头细胞的生长状态 1a:凝集生长毛乳头细胞,细胞呈现聚集成细胞团的生长特点;1b:非凝集生长毛乳头细胞,细胞呈现成纤维细胞特点,呈梭形,非聚集生长

二、双向电泳结果

本研究建立了重复性较好、分辨率较高的双向凝胶电泳银染图谱(图2)。在凝集生长和非凝集生长的DPC分泌性蛋白质中分别检测到(1 134±52)个和(1 078±36)个蛋白点,各点清晰独立。差异蛋白点主要集中在分子量较低的蛋白质,与分泌性蛋白质的特点相吻合。按照差异量在5倍以上的标准,凝集生长和非凝集生长毛乳头细胞存在差异蛋白质28个。

图2 毛乳头细胞分泌性差异蛋白质双向电泳图谱,二者大多匹配,差异点主要集中在低分子量蛋白质,在此区域凝集生长毛乳头细胞的蛋白点数高于非凝集生长毛乳头细胞 2a:凝集生长毛乳头细胞;2b:非凝集生长毛乳头细胞

三、质谱鉴定和数据库检索

通过MALDI-TOF/TOF质谱仪鉴定差异蛋白点,11个蛋白点获得很好的PMF图谱,与10个蛋白质相匹配(表1),其中8种蛋白质表达上调,分别为Rho GDP分离抑制剂1(Rhogdi 1)、细丝蛋白A、胱抑素C、纤维连接蛋白、亲环素A、前胶原C端蛋白酶增强子(PCPE-1)、组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、组织金属蛋白酶-2抑制剂(TIMP-2);2种蛋白质表达下调,为神经肽h3和基质金属蛋白酶-3金属蛋白酶组织抑制剂-1复合物(Mmp-3TIMP-1)复合物。根据质谱鉴定信息查询数据库,这些差异蛋白质主要参与了细胞信号转导、细胞外基质合成及降解等生理过程等。

表1 凝集生长和非凝集生长毛乳头细胞质谱鉴定的差异分泌蛋白质

讨论

毛乳头是毛囊生长和毛发周期的控制中心,毛乳头细胞的生长状态决定其生理功能,因此研究凝集和非凝集生长状态下毛乳头细胞蛋白表达差异有助于阐明毛乳头在毛囊生长和周期调控中的作用。比较蛋白质组学已经成功用于分泌性蛋白质组研究[4]。本实验中,我们应用比较蛋白组学技术对凝集和非凝集生长状态下毛乳头细胞分泌的差异蛋白质进行了研究,在多次探索实验条件后,根据优化的实验条件进行双向电泳,获得了重复性较好、分辨率较高的双向凝胶电泳银染图谱。在凝集和非凝集生长的DPC分泌性蛋白质中分别检测到(1 134± 52)个和(1 078±36)个蛋白点,各点清晰独立。按照差异量在5倍以上的标准,凝集生长和非凝集生长毛乳头细胞存在差异蛋白质28个,其中11个获得良好的肽质量指纹谱,与10种蛋白质相匹配,8种蛋白质在凝集性生长状态下表达上调,2种蛋白质在凝集性生长条件下表达下调。通过数据库查询得知,这些差异蛋白质主要参与了细胞信号转导、细胞外基质合成及降解等生理过程等。

由于DPC分泌性蛋白质以低丰度的形式存在,增加了通过双向电泳进行分析的难度,为此我们采用了与质谱兼容的银染法,在保证蛋白较好分离的基础上增加了敏感性。本实验鉴定的10种差异蛋白质中5种蛋白质参与信号通路、细胞增殖与分化,包括细丝蛋白、纤维连接蛋白、胱抑素C、亲环素A和Rho GDI 1。细丝蛋白参与细胞核和细胞质信号通路[5];纤维连接蛋白和胱抑素C参与细胞增殖等[6-7]。亲环素A参与信号转导,维持发育中或变性蛋白质的正确结构[8]。Rho GDI 1参与细胞运动调控[9]。4种蛋白质为细胞外基质蛋白,包括 TIMP、TIMP-2、Mmp-3TIMP-1和PCPE-1,在调节细胞外基质蛋白的合成和降解中发挥关键作用[10-11]。我们推测,这些信号分子和基质蛋白可能与毛乳头细胞的凝集性生长和毛囊生长发育相关。

神经肽是存在于神经组织并参与神经系统功能作用的一类特殊的信息物质,神经肽h3曾在肺癌组织中被发现[12],未见于其他组织和细胞。本研究中神经肽h3的出现是否与毛乳头生长相关尚不清楚,需要深入探讨。

[1]McElwee KJ，Hoffmann R.Growth factors in early hair follicle morphogenesis[J].Eur J Dermatol，2000，10(5):341-350.

[2]夏汝山，郝飞，杨希川，等.毛乳头细胞分泌性蛋白质组的制备[J].中华皮肤科杂志，2013，46(2):57-58.

[3]Görg A，Obermaier C，Boguth G，et al.T he current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients [J].Electrophoresis，2000，21(6):1037-1053.

[4]杨立群，陈晓栋，姚晓东.非标记定量技术研究瘢痕疙瘩的蛋白质组学特点[J].中华皮肤科杂志，2012，45(3):173-177.

[5]Uribe R，Jay D.A review of actin binding proteins:new perspectives [J].Mol Biol Rep，2009，36(1):121-125.

[6]Singh P，Schwarzbauer JE.Fibronectin and stem cell differentiationlessons from chondrogenesis[J].J Cell Sci，2012，125(Pt 16): 3703-3712.

[7]Korolenko TA.Cystatins:biological role and changes in pathology [J].Vestn Ross Akad Med Nauk，2008，(4):43-47.

[8]Lee J.Role of cyclophilin a during oncogenesis[J].Arch Pharm Res，2010，33(2):181-187.

[9]DovasA，CouchmanJR.RhoGDI:multiplefunctionsintheregulation of Rho family GTPase activities[J].Biochem J，2005，390(Pt 1): 1-9.

[10]Weiss T，Ricard-Blum S，Moschcovich L，et al.Binding of procollagen C-proteinase enhancer-1 (PCPE-1)to heparin/ heparan sulfate:properties and role in PCPE-1 interaction with cells[J].J Biol Chem，2010，285(44):33867-33874.

[11]Wasilewska A，Taranta-Janusz K，Zoch-Zwierz W，et al.Role of matrix metalloproteinases(MMP)and their tissue inhibitors (TIMP)in nephrology[J].Przegl Lek，2009，66(9):485-490.

[12]罗国安，邓斌，叶能胜，等.肺鳞癌和小细胞肺癌组织比较蛋白质组学研究[J].高等学校化学学报，2005，26(9):1645-1649.

2014-01-01)

(本文编辑:吴晓初)

A preliminary analysis of the secretome of aggregated dermal papilla cells

Xia Rushan，Gu Jing，Tao Shiqin，Yang Lijia.Department of Dermatology，Wuxi No.2 People′s Hospital，Nanjing Medical University，Wuxi 214002，Jiangsu，China

Yang Lijia，Email:yanglijia726@163.com

ObjectiveTo study the expression of secreted proteins in aggregated dermal papilla cells (DPCs).MethodsDPCs were isolated from human scalp tissue and subjected to primary culture and subculture. Aggregated and non-aggregated DPCs served as the subject of this study.Secreted proteins were prepared from these cells and subjected to two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.Differentially expressed proteins were screened by the PDQuest image analysis software.Protein spots were digested and identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight(MALDI-TOF)mass spectrometry，and finally analyzed using the National Center forBiotechnologyInformation (NCBI)non-redundant(Nr)proteindatabase.ResultsTwo-dimensional electrophoresis maps with good repeatability and high resolution were established.Image analysis of 2-D gels revealed that the average number of detected protein spots was 1 134±52 and 1 078±36 in aggregated and nonaggregated DPCs respectively，and the majority of these protein spots were matched between aggregated and nonaggregated DPCs.Twenty-eight protein spots showed more than 5-fold difference between the two groups of cells，and 10 proteins were preliminarily identified as differentially expressed proteins by peptide-mass fingerprinting.Of these differentially expressed proteins，8 proteins including Rhogdi 1，filamin A，cystatin C，fibronectin，cyclophilin A，procollagen C proteinase enhancer 1，tissue inhibitor of metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 were up-regulated，and 2 proteins including neuropolypeptide h3 and matrix metalloproteinase-3/tissue inhibitor of metalloproteinase-1 complex were down-regulated in aggregated DPCs compared with non-aggregated DPCs.ConclusionsDifferentially expressed proteins between aggregated and non-aggregated DPCs are mainly implicated in cell signaling pathway，cellular proliferation and differentiation，extracellular matrix synthesis and degradation，and so on.

Dermal papilla cells;Secretory proteins;Electrophoresis，gel，two-dimensional;MALDI-TOF mass spectrometry

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.003

南京医科大学科技发展基金(2011NJMUZ05);无锡市卫生局科研计划项目(ML201202)

214002江苏无锡,南京医科大学附属无锡市第二人民医院皮肤科

杨莉佳,Email:yanglijia726@163.com