Alzheimer病患者外周血单个核细胞产生细胞因子的变化和意义

刘 捷 (洛阳新区人民医院内科，河南 洛阳 471023)

慢性炎症在Alzheimer病(AD)的神经病理中起一定的作用。白介素(IL)-1与淀粉样β蛋白(Aβ)相关〔1〕，IL-1刺激淀粉样前蛋白(APP)的合成和mRNA的翻译〔2〕。血细胞表达APP mRNA和蛋白增加来自AD患者的外周血单个核细胞(PBMC)的APP mRNA增加〔3〕，这可能与潜在的脑内异常的淀粉样沉积有关〔4〕。另一方面，Aβ刺激培养的人单核细胞产生和释放IL-1β和IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)。AD病人的淋巴细胞对Aβ刺激反应低表明T细胞无能〔5〕。这些研究表明从脑到外周存在炎症信号途径，但是诱导的机制不清楚。本研究旨在分析不同老年人群的PBMC对不同刺激产生的反应，以确定细胞对环境的相对影响，研究炎症因子在AD致病机制和诊断中的作用。

1 材料和方法

1.1 对象 血液标本来自24名轻度认知功能障碍(MCI)患者，平均年龄(75.06 ± 1.34)岁，男12例，女12例;8例轻度AD病人和20名健康的老年人〔年龄(73.10 ±1.57)岁〕。MCI和对照组年龄无显著差异。但是，轻度AD患者比对照组的年龄大(P＜0.05)。所有研究对象均进行体检，包括血液检查、MRI和迷你精神状态检查(MMSE)，逻辑记忆Ⅰ、Ⅱ试验和临床痴呆分析(CDR)。MCI的分类依据逻辑记忆Ⅱ的异常记忆或一个CDR的分数确定(用于区别MCI和AD)。排除神经疾病、头部受伤史、DSM-IV抑郁症、任何不稳定的医学状态、嗜酒和吸毒者。排除服用神经松弛剂、慢性抗焦虑剂和镇静剂。本研究得到了医院伦理委员会的同意，与患者本人或监护人签订了知情同意书。

1.2 细胞分离和培养条件 血液标本用10 ml肝素抗凝管收集。用Ficoll-Hypaque密度梯度分离液离心分离PBMCs，并以106细胞/ml含10%胎牛血清、非必需氨基酸、1 mmol/L丙酮酸钠、50 U/ml青霉素和50 mg/ml链霉素RPMI1640培养基培养在12孔板中。细胞在37℃，5%CO2完全培养基或用2 μg/ml植物血凝素(PHA)或10 μg/ml脂多糖(LPS)培养24 h或48 h。收集细胞培养上清液并保存在-70℃冰箱。

1.3 ELISA检测培养上清液中的细胞因子 采用ELISA试剂盒(上海科华生物技术有限公司)检测细胞培养上清液中的IL-12p70，肿瘤坏死因子(TNF)-α，IL-10，IL-6，IL-1β 和 IL-8 浓度，参照试剂盒说明书进行操作，并计算IL-1β/IL-10、IL-6/IL-10、TNF-α/IL-10、IL-8/IL-10 的比值。

1.4 统计学方法 应用SPSS12.0.1软件进行分析。数据资料采用均数(标准差)表示，组间比较用U检验。

2 结果

2.1 各组 IL-12p70，TNF-α，IL-10，IL-6，IL-1β 及 IL-8 比较PHA刺激PBMCs 24 h后产生的IL-6、IL-8和IL-10水平MCI组显著高于对照组(均P＜0.05)，但培养48 h后这种差异消失。当LPS刺激PBMCs时，不同组间绝对细胞因子浓度没有显著性差异;但是MCI组与对照组相比TNF-α/IL-10、IL-6/IL-10和IL-8/IL-10水平显著降低(P ＜0.05或P ＜0.01)。见表1，表2。

2.2 血浆中IL-6、IL-8和 IL-10的浓度 对照组IL-8水平为(10.7 ±4.2)pg/ml，MCI组 IL-8 水平为(6.4 ±2.6)pg/ml，轻度AD 组 IL-8水平为(9.4 ±4.7)pg/ml，对照组、MCI和轻度 AD患者血浆IL-8水平无显著差异(P＞0.05)。各组的血浆中没有检测到IL-6和IL-10，可能低于试剂盒的检测限。

表1 PHA或LPS刺激PBMCs 24 h或48 h产生的细胞因子〔均数(标准差)〕

3 讨论

在对健康老年人、MCI和AD患者外周血培养的PBMCs产生的细胞因子的研究中，发现当PBMCs细胞用PHA刺激24 h后，来自MCI的PBMCs产生的 IL-6、IL-8和IL-10显著高于对照组，但是刺激48 h则不存在这种情况。可能因为PHA刺激48 h后细胞因子的释放达到一个平台，或MCI患者的PBMCs更容易受刺激而产生细胞因子，而对照组的PBMCs需要经过一段时间刺激后才能产生与MCI组类似水平;发现抗炎因子IL-10也增加，可能是对前炎症因子IL-6和IL-8的增加作出的反应〔6〕。在不同的时间点检测用LPS刺激后绝对细胞因子的浓度，组间没有显著性差异。但是，MCI与对照比较，LPS刺激4 h后导致 TNF-α/IL-10，IL-6/IL-10和 IL-8/IL-10的比值降低，这表明对IL-10反应的炎症因子较快产生反应而减少。这与同PHA的刺激可以比较。孵育15 h后PHA刺激淋巴细胞增殖，增加DNA聚合酶的活性，而LPS刺激单核细胞释放IL-1和TNF-α〔7〕。PHA和LPS不同的影响表明MCI患者免疫细胞类型发生了改变，因而产生的细胞因子也发生变化。

Lindberg等〔8〕已经发现在AD早期和晚期可溶性IL-1受体Ⅱ(sIL-1RⅡ)在脑脊液和血清中没有差异，表明在AD早期和晚期IL-1系统没有受到损害。本研究结果与之一致，另外本研究表明LPS不是PHA刺激PBMCs产生相对较高的IL-10。重度AD病人外周血用LPS刺激减少IL-1β、IL-6、和TNF-α的释放，但与轻度和中度AD患者以及对照没有差异〔9〕，即在AD病人中早期斑块相关的小神经胶原细胞增加IL-1α的表达，但在AD后期则下降，表明小胶质神经细胞核炎症在斑块发展的早期起作用。

本研究结果显示MCI病人中PBMCs产生的细胞因子在临床AD之前已发生改变。但是，这可能不能完全用前炎症的改变来解释，因为用PHA刺激细胞抗炎因子IL-10随着IL-6和IL-8增加而增加。而在PHA刺激因子产生的趋势似乎在MCI患者达到高峰，然后一旦进展到早期AD，则产生的细胞因子回到对照组的水平或以下。据报道〔10〕在AD发展之前可见到脑脊髓膜内的炎症，但与严重的AD和脉管性痴呆比较，血清TNF-α的水平在轻度-中度AD显著性降低，表明在不同的AD阶段和其他痴呆类型之间有不同的细胞因子谱，这与本研究结果一致。

对TNF-α和IL-1反应释放的IL-6在血浆中持续时间较长，所以是一种前炎症细胞因子活化的有用指示〔11〕。由于MCI人群的异质性导致IL-6的结果波动很大，从而阻止IL-6作为MCI的生物标志物。Aβ刺激小胶质神经细胞产生IL-6、IL-1、TNF-α和IL-8，不是IL-10。在外周血单个核细胞中，Aβ刺激IL-1β、IL-1Rα 的释放，不是 IL-6，IL-10和 TGF-β。来自 AD 患者的B细胞被证明产生Aβ反应性的自身抗体。小鼠颅内注射Aβ能引起脑和血浆中IL-6的增加，表明Aβ在中枢神经系统的沉积引起外周免疫反应的改变。而且，表达人APP的转基因小鼠能减少对Aβ引起的淋巴细胞的增殖和细胞因子的产生〔12〕。与对照比较来自AD患者的淋巴细胞对淀粉样多肽的刺激较少产生反应。这些发现意味着慢性的Aβ刺激导致的对Aβ的细胞免疫反应可能加重它在AD患者脑内的积聚。

1 陆 晖.盐酸丁咯地尔治疗血管性痴呆的临床分析〔J〕.广西医学，2002;24(12):2153-55.

2 Rogers JT，Leiter LM，McPhee J，et al.Translation of the alzheimer amyloid precursor protein mRNA is up-regulated by interleukin-1 through 5＇-untranslated region sequences〔J〕.J Biol Chem，1999;274(10):6421-31.

3 Schlossmacher MG，Ostaszewski BL，Hecker LI，et al.Detection of distinct isoform patterns of the beta-amyloid precursor protein in human platelets and lymphocytes〔J〕.Neurobiol Aging，1992;13(3):421-34.

4 Reale M，Iarlori C，Gambi F，et al.Acetylcholinesterase inhibitors effects on oncostatin-M，interleukin-1 beta and interleukin-6 release from lymphocytes of Alzheimer＇s disease patients〔J〕.Exp Gerontol，2005;40(3):165-71.

5 Trieb K，Ransmayr G，Sgonc R，et al.APP peptides stimulate lymphocyte proliferation in normals，but not in patients with Alzheimer＇s disease〔J〕.Neurobiol Aging，1996;17(4):541-7.

6 易 辉，王树立，崔江禹，等.COPD患者C反应蛋白、TNF-α、IL-8、IL-6临床研究〔J〕.现代生物医学进展，2011;11(3):534-7.

7 Hsu HY，Wen MH.Lipopolysaccharide-mediated reactive oxygen species and signal transduction in the regulation of interleukin-1 gene expression〔J〕.J Biol Chem，2002;277(25):22131-9.

8 Lindberg C，Chromek M，Ahrengart L，et al.Soluble interleukin-1receptor type II，IL-18 and caspase-1 in mild cognitive impairment and severe Alzheimer＇s disease〔J〕.Neurochem Int，2005;46(7):551-7.

9 Sala G，Galimberti G，Canevari C，et al.Peripheral cytokine release in Alzheimer patients:correlation with disease severity〔J〕.Neurobiol Aging，2003;24(7):909-14.

10 Tarkowski E，Andreasen N，Tarkowski A，et al.Intrathecal inflammation precedes development of Alzheimer＇s disease〔J〕.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2003;74(9):1200-5.

11 Franciosi S，Choi HB，Kim SU，et al.IL-8 enhancement of amyloid-beta(Abeta 1-42)-induced expression and production of pro-inflammatory cytokines and COX-2 in cultured human microglia〔J〕.J Neuroimmunol，2005;159(1-2):66-74.

12 Monsonego A，Maron R，Zota V，et al.Immune hyporesponsiveness to amyloid beta peptide in amyloid precursor protein transgenic mice:implications for the pathogenesis and treatment of Alzheimer＇s disease〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2001;98(18):10273-8.