MicroRNAs、uPA及MMP-3在骨关节炎患者滑膜组织中的表达及相关性

王维山 史晨辉 何仁豪 周圆家 陈安民 郭风劲

(石河子大学医学院第一附属医院骨科，新疆 石河子 832008)

骨关节炎(OA)是严重影响中老年人生活质量的疾病之一。目前普遍认为肥胖、年龄、解剖结构异常、关节创伤病史、关节反复磨损和关节的过度使用都是造成OA发病的因素，但其具体病因学仍然不清。关节软骨的再生能力极差，一旦OA病理过程启动，将逐渐演变为以关节功能障碍为代价的关节疾患。在关节软骨组织降解中，蛋白降解酶发挥至关重要的作用，尤其是以尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)为代表的丝氨酸蛋白降解酶系和以基质金属蛋白酶3(MMP-3)为代表的基质金属蛋白酶系作用最明显〔1～3〕。近年来越来越多的证据显示microRNAs在OA的病变过程中具有关键性的调控作用〔4～6〕。miR-27a通过调控靶基因uPA、miR-140通过调控靶基因MMP-3的表达参与关节软骨组织的退变过程。本研究通过检测OA患者关节滑膜组织中 miRNA-140、miRNA-27a、uPA和 MMP-3的表达情况，探讨它们之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料 所有病例均选取2011年11月至2012年4月就诊于石河子大学医学院第一附属医院的住院患者，符合中华医学会骨科学分会2007年颁布的骨关节炎诊治指南中OA的诊断标准〔7〕，并经关节镜术中证实软骨退变。OA组33例，男15例，女18例，年龄43～78岁，平均65.2岁，病程8个月～22年，平均10.7年。排除标准:2个月内服用皮质激素类药物者;患有肝肾功能异常、恶性肿瘤、感染性疾病者;抗“O”、类风湿因子阳性、血沉、C反应蛋白异常者以及妊娠和哺乳期妇女。对照组均来自因外伤行截肢的膝关节和单纯膝外伤行关节镜探查者，入选28例，男13例，女15例，年龄28～66岁，平均51.3岁。术中获取标本后立即植入液氮中-80℃保存。本实验得到石河子大学医学伦理委员会的支持，所有患者均自愿签定知情同意书。

1.2 试剂 miRNA提取试剂盒、反转录试剂盒、Trizol试剂、Real-time PCR试剂盒引物、胶回收纯化试剂盒均购自美国ABI公司;引物 miRNA-140、miRNA-27a、uPA、MMP-3及内参 U6由美国ABI公司合成。

1.3 方法

1.3.1 总RNA提取 将标本约100 mg放于研钵中，加入液氮后迅速研碎，在无酶EP管中按mirVanaTMmiRNA Isolation Kit中的提取步骤提取总RNA，使用超微量紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。

1.3.2 反转录合成cDNA 按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit的操作说明将总RNA浓度稀释为1～10 ng，配备试剂盒中的混合液7 μl/份，与5 μl RNA 样本、3 μl引物及内参U6形成15 μl的反应体系，反应条件为:16℃ 30 min，42℃30 min，85℃ 5 min。

1.3.3 实时荧光定量PCR检测 按照反应体系配置说明配备总反应液20 μl，其中 TaqManⓇ2 ×Universal PCR Master Mix，No AmpErase UNGⓇ10 μl;Nuclease-free water 7.76 μl;Product from RT reaction 1.33 μl;Custom TaqManⓇSmall RNA Assay(20 × )1 μl，每个样本设 3 个复孔，反应条件为:95℃ 10 min，95℃15 s，60℃ 1 min，共40个循环。应用ABI Prism 7700 system 提供的分析软件Rotor-Gene real-time PCR analysis software进行分析。△Ct=CtmiRNA-CtU6，以2-△△CT表示每个miRNA的相对表达量，经过对数换算后作为统计分析数据。

1.4 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行分析，数据用s表示，组间比较采用独立样本t检验，各指标间相关性采用Pearson分析。

2 结果

2.1 滑膜组织中miRNA表达水平 实时荧光定量PCR检测33例OA患者和28例非OA患者滑膜组织中miRNA-27a、miRNA-140、uPA mRNA和MMP-3 mRNA的表达扩增曲线良好，扩增效率高。其中miRNA-27a和miRNA-140在OA组中表达水平(1.63 ±0.93、0.94 ± 0.60)显著低于对照组(3.34±1.68、2.55 ±1.12)，差异有统计学意义(t=-4.121、t=-5.934，P ＜0.001);其中 uPA mRNA 和 MMP-3 mRNA 在 OA组中表达水平(3.52 ±1.79、4.91 ± 1.86)显著高于对照组(1.16 ±0.65、0.84 ± 0.57)，差异有统计学意义(t=5.284、t=8.881，P ＜0.001)。

2.2 滑膜组织中miRNA表达的相关关系 OA组内miR-27a和uPA呈显著相关，相关系数为r=-0.699(P ＜0.01)，miR-140和MMP-3呈显著相关，相关系数为r=-0.598(P＜0.01);uPA和MMP-3之间也有相关性，相关系数为r=0.444(P＜0.05)。对照组uPA和MMP-3之间也呈相关性，相关系数为r=0.652(P＜0.01)，其他各指标相互之间均无相关关系。见图1。

表1 两组滑膜组织中miRNA-140、miRNA-27a、uPA、MMP-3之间的相关关系

图1 MMP-3/miRNA-140、uPA/miRNA-27a、uPA/MMP-3之间的相关关系

3 讨论

OA最基本的病理变化特征是软骨下骨代谢异常及软骨组织细胞外基质的降解，从而出现软骨组织的退变，继发出现关节周围结构的病理改变，最终导致关节功能障碍。目前对OA病因学及治疗研究的侧重点在软骨下骨的代谢改变及关节软骨的病理性损伤，其中蛋白降解酶的作用已成为众多学者公认的最基本也最为关键的OA病理机制，在众多降解酶系中，uPA和MMP-3的作用最为突出。已有的多方面文献〔8，9〕证实，uPA在软骨退变中发挥着始动因子的作用，是整个MMPs激活途径的关键分子。敲除uPA基因的小鼠行蛋白诱导性关节炎模型〔10〕，结果显示关节炎病变程度明显滞后，且软骨程度显著低于野生型小鼠。应用uPA抑制剂后发现〔11〕，通过外源性uPA诱导软骨退变模型只有不到一半的成功率，而未使用抑制剂的动物均发生了软骨退变。我们前期通过向兔关节注射外源性uPA发现，其可快速诱导软骨降解过程，周期明显短于其他蛋白酶的作用过程〔12〕。由于uPA主要作用底物为Pro-MMP-3，因此其在OA病变过程中可能与MMP-3的关系更加密切。我们前期的研究〔13，14〕显示:在OA滑膜衬里层、滑膜下层细胞中uPA/uPA mRNA大量表达，其表达水平与关节退变呈正相关。在OA关节液中，MMP-3表达显著高于正常对照组，也间接说明uPA和MMP-3在OA病变中的重要作用。

近年来随着非编码RNA的深入广泛研究，越来越多的证据表明microRNAs在OA软骨下骨及软骨组织的生理病理代谢过程中发挥至关重要的调控作用，多位学者通过RT-PCR等技术检测了OA患者及健康者软骨组织、滑膜组织及关节液中microRNAs表达的差异，结果显示具有差异表达的microRNAs较多，通过验证 microRNAs功能显示，miR-146a、miR-140、miR-455、miR-9和 miR-27a等均参与了 OA软骨退变过程的调控〔15～18〕。Akhtar等〔19〕研究显示，miR-27b 通过上调 MMP13 表达促进软骨组织的快速退变;另外，miRNA-140可以引起关节滑膜组织中IL-1β的大量表达，进而参与软骨的降解过程〔20〕。

以上研究提示microRNAs、MMPs和uPA在OA软骨、滑膜病变过程中发挥着重要的调控作用，但他们之间的相互作用关系尚未见文献报道。本研究结果表明miR-27a、miR-140、uPA和MMP-3在OA病理变化中起着重要的作用，并且相互之间存在某种调控关系。软骨细胞在刺激因素的作用下产生miR-140，调控Pro-MMP-3表达;产生 miR-27a调控 uPA表达;Pro-MMP-3在uPA磷酸化后变为有活性的MMP-3，Pro-MMP-13在MT-MMP的作用下变为活性MMP-13，MMP-3和MMP-13又可激活由软骨细胞和滑膜细胞分泌的Pro-MMP-9转变为活性的MMP-9，活性MMPs共同作用导致软骨组织降解。

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