金银花HQT基因变异类型与其绿原酸含量相关性

吴敏琳，孙小琳，朱莎莎，李卫东，白根本

(北京中医药大学，北京100102)

金银花(Lonicera japonica Thunb)又名忍冬，为忍冬科忍冬属植物［1］，具有清热解毒、凉散风热、广谱抗菌及抗病毒等功效，临床上治疗湿病发热、风热感冒、咽喉肿痛、肺炎等多种疾病，有“中药之中的青霉素”之称［2-3］。《本草纲目》记载“忍冬，茎叶及花，功用皆同”。金银花在其道地产区山东已有300余年的栽培历史，长期的自然选择与人工选择，金银花的种质发生了明显的变异与分化，形成的种质形态、产量及质量均存在较大差异［4-5］。有机酸类被认为是金银花清热解毒的药理基础，其中常以绿原酸(chlorogenic acid，CGA)作为金银花的质量控制指标［6］。而目前公认的绿原酸合成途径有3条，经研究表明，通过HQT(hydroxycinnamoyl CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase)合成绿原酸的途径为其主要合成途径［7］。HQT功能基因的变异可通过改变其蛋白活性来调控绿原酸的生物合成效率。本文拟从不同金银花品种中克隆HQT基因编码区序列，通过多重序列比对，揭示金银花HQT基因变异并按其编码氨基酸的差异进行分类，再结合其绿原酸含量的变化，阐明金银花HQT基因的与绿原酸生物合成的关系。

1 实验材料

1.1 植物材料 研究所用的12个忍冬品种(见表1)，分别来自山东、河北、河南等金银花主要栽培区。试验材料均采自山东平邑九间棚公司金银花种质资源收集圃。

表1 金银花样品

1.2 试剂 RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen-Sample＆Assay Technologies)，SuperScript?VILOTMcDNA Synthesis Kit、AccuPrimeTMPfx Super Mix(Lifetechologies)，100 bp Plus II DNA Ladder(北京全式金生物技术有限公司)，绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，生产批号为11075-200413)。

1.3 仪器 SIGMA 3K-15低温高速离心机(Sigma);凝胶成像分析仪(BIO-RAD)，DYY-6C电泳仪、水平电泳槽(北京市六一仪器厂)，SANYO－80℃超低温冰箱、制冰机(SANYO)，GeneAmp9600 PCR仪(Applied Biosystems)，DHG-9053A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)，KQ-300VDE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BP211S电子天平(Sartorius)，高效液相色谱仪(Waters)。

2 实验方法

2.1 总RNA提取及逆转录 采用Qiagen公司的RNA提取试剂盒提取各样品的总RNA，1.2%琼脂糖变性胶电泳检测。逆转录反应体系步骤如下:在微量离心管中配制20 μL混合液，包含模板RNA 2.5 μg，5X VILO［TM］Reaction Mix 4 μL，10X SuperScript?Enzyme Mix 2 μL，DEPC-treated water up to 20 μL。25℃保温10 min，42 ℃保温60 min，85 ℃保温5 min，产物于－20℃保存。

2.2 PCR扩增HQT基因编码区序列 根据金银花HQT基因编码区的 cDNA序列［8］，用 Primer Primer 5.0软件在cDNA末端设计引物扩增金银花HQT基因编码区，引物序列如下，上游引物HQT-F:CATGCCATGGCTATGGGAAGTGAAGGAAGTGTGAA;下游引物 HQT-R:TCCCCCGGGTCAGAACTCGTACAAACACTTCTCAAA。PCR 反应体系(25 μL):AccuPrime PfxSuper Mix 22.5 μL，Forward and reverse primers(10 μmol)1 μL，Template DNA solution(10 pg – 200 ng)0.5 μL。PCR 反应程序:95 ℃预变性5 min，95℃变性15 s，58℃退火30 s，68℃延伸30 s，共进行35个循环，4℃保存。

2.4 HQT基因编码区序列的生物信息学分析 各样本的测序结果用MEGA 5.0软件分析，并辅以人工校对。利用NCBI的Blast功能进行序列相似相比较，利用MEGA 5.0软件对HQT基因序列进行聚类进化分析。

2.5 绿原酸含量测定及方法学验证

2.5.1 色谱条件 色谱柱为Agilent C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.4% 磷酸(13∶87)，进样量为5 μL，流速 1 mL/min，柱温25℃，检测波长327 nm。

2.5.2 对照品溶液及供试品溶液制备［9］对照品溶液制备:精密称取绿原酸标准品2.55 mg，加入50%甲醇配制终浓度为0.051 mg/mL的对照品溶液。供试品溶液制备:精密称取金银花样品粉末0.1 g(过药典4号筛)，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加50%的甲醇20 mL，超声(270 W，45 kHz)30 min，放冷后称定补重，摇匀后过滤，精密量取续滤液10 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇定容。

2.5.3 线性试验 按照2.5.1项下的色谱条件，将2.5.2项下配制的绿原酸标准品分别进样2，4，6，8，10 μL，记录峰面积。

2.5.4 样品含量测定 取不同样品按供试液制备方法制样并测定，按外标法计算绿原酸的含量。

2.5.5 精密度试验 取同一份对照品溶液，按照设定的色谱条件，重复进样6次测定。

2.5.6 重复性试验 取同批样品(九丰一号)6份，按供试液制备方法制样并测定。

2.5.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液(九绿一号)，分别在 0，1，2，4，8，12，24 h 时测定含量。

催化燃烧热空气脱附法是采用催化燃烧反应后的热气体（控制温度）加热吸附床，脱附出来的有机气体进入催化燃烧阶段净化处理，从而脱附净化。催化燃烧脱附法所需催化剂的费用较高，并且具有一定的安全隐患。

2.5.8 回收率试验 精密称取已知含量的供试品(九绿一号)6份，分别加入6组不同量的绿原酸对照品，按供试液制备方法制样并测定，每一水平测定3次。

3 结果与分析

3.1 HQT基因的测序 从12种金银花样品中PCR得到了7条HQT基因cDNA编码序列，长度约1 300 bp。按样品编号分别将这12条序列编号为1～12，12条序列一致度为98.3% ～100%。利用NCBI的BLAST进行序列相似性比较，与金银花HQT基因序列［7］(GenBank accession:GQ847546)相 似 性 大 于98%，确定了获得的cDNA片段为金银花HQT基因的cDNA片段。

3.2 HQT基因编码区序列的变异分析 对12条HQT基因的编码区序列进行分析，变异情况见表2。

表2 金银花HQT基因编码序列变异

对表2进行分析，发现HQT基因序列中主要存在以下2种情况的突变，1)单核苷酸多态性(SNPs):进行比对的12条HQT基因，其编码区共有24处SNPs，如在360 bp处的T-A转换，410 bp处的A-C颠换。2)插入/缺失突变:在1～6 bp的位点上，3号样本存在ATGGCT 6个碱基的插入，但是未引起移码突变，开放阅读框完整，为1 326 bp，比其它序列开放阅读框长度增加6 bp。

3.3 HQT氨基酸序列多态性分析 利用MEGA 5.0软件将12条核酸序列翻译成对应的氨基酸，得到长439～441的HQT蛋白氨基酸序列，变异情况见表3。对表3进行分析，共发现在4个位点氨基酸发生了突变，其中3号样品存在一处由2个氨基酸插入引起的突变，这一突变使得3号样品的起始密码子提前，比其他样品氨基酸序列多了2个氨基酸残基。

表3 金银花HQT蛋白的氨基酸序列变异

3.4 绿原酸含量测定与方法学验证

3.4.1 线性 以进样量为纵坐标Y，峰面积为横坐标X，绘制标准曲线，得回归方程Y=0.000 000 3 X+0.013 1，R2=0.999 7。表明绿原酸在0.102 ～0.510 μg范围内线性关系良好。

3.4.2 样品含量 每份样品重复测定3次，取平均值，结果见表4。

表4 样品绿原酸含量测定结果

3.4.3 精密度、重现性、稳定性、回收率 仪器精密度RSD=0.18%，说明仪器精密度良好。供试品溶液制备方法重现性RSD=1.76%，说明制备方法重现性高。样品稳定性RSD=0.84%，表明供试液中的待测组分在24 h内是稳定的。平均回收率=100.28%，RSD=0.11%(n=6)，以上验证结果说明实验方法和数据科学有效。

4 讨论

目前公认的绿原酸合成途径有3条，其中通过HQT催化咖啡酰-CoA与奎尼酸生成绿原酸［10］的途径是植物体内合成绿原酸的主要途径，本文在对金银花HQT基因编码区序列进行研究时发现其具有多态性。

按照表3中4个位点可将HQT基因的突变分为3个类型:类型Ⅰ，在第137、324位点分别是丙氨酸和缬氨酸;类型Ⅱ(3号样品)，在第1、2位点分别是甲硫氨酸和丙氨酸;类型Ⅲ(4号样品)，在第137、324位点分别是天冬氨酸和丙氨酸。结合表4的结果分析:类型Ⅱ绿原酸含量为1.20%，是所有实验样品中含量最少的;类型Ⅲ绿原酸含量为1.89%，相对大多数品种其含量也较少;类型Ⅰ中各实验品种绿原酸含量均大于2%。综合两项结果发现，HQT基因变异在一定程度上影响了其表达产物绿原酸的含量，证明了二者之间具有一定的相关性。

其中4号样品的众多突变证实了不同种类忍冬的HQT蛋白在基因水平上存在有明显的差异;5号样品为金银花的变种(红白忍冬)，其绿原酸含量明显高于其他二倍体品种。以上两点从不同层面上证明了忍冬分类的准确性。

绿原酸含量之所以存在明显的差异，除了基因变异造成的影响，还可能有多种因素的共同作用:如外部环境的影响，生长在阳坡的金银花不同器官中绿原酸的含量均高于阴坡的同类样品［11］;干旱、低温以及病害感染，都可促使磷酸戊糖途径的比重增大，使绿原酸含量增多［12］等。另外，实验结果中5号样品是四倍体，其绿原酸含量约为其他普通二倍体品种的2倍左右。由此可见绿原酸的积累有其复杂的生理学机制，还有待进一步的具体研究。

本文对金银花功能蛋白HQT进行基因编码区多态性分析，发现HQT基因具有丰富的变异，其错义突变导致了HQT蛋白的改变，进而导致了不同品种的样品中绿原酸含量产生差异。本文发现了金银花HQT基因编码区和绿原酸含量及种间分类具有一定的相关性。为科学的利用和开发金银花资源奠定理论基础和提供科学手段，为以后的研究工作提供有价值的参考。

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