PVA加门腔分流术对肝硬化大鼠肝脏组织中iNOS水平的影响

蔡潮农，方瑞君，李培平，张百萌，关晓东，李 坚

(1中山大学附属第五医院，广东珠海519000;2北京师范大学珠海校区门诊部)

门静脉动脉化(PVA)在肝硬化门静脉高压症及肝脏外科方面有良好的应用前景，但目前研究发现该技术尚存在一些问题，比如长期未加限流措施的动脉化或未行门静脉分流的动脉化可能导致肝脏实质结构改变，包括门脉内膜纤维化、坏死性血管炎、肝实质纤维化等［1，2］。正常情况下，肝组织中主要表达内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)无或仅有少量表达，后者在肝组织受到内毒素(LPS)、肿瘤坏死因子(TNF)及干扰素lp(IFN-lp)等细胞因子刺激后表达增加，活性可持续较长时间，催化NO大量持续产生，介导广泛的毒性作用［1，3］。在氧化应激造成的肝损伤中，iNOS的表达与肝细胞坏死程度有关［4］。2012年11月～2013年12月，我们观察了PVA加门静脉分流术(PCS)对肝硬化大鼠肝组织中iNOS表达的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 模型建立与分组处理 健康雄性 Sprague-Dawley大鼠190只，体质量(250±20)g，SPF级，由中山大学实验动物中心提供。参照文献［5］采用纯四氯化碳(CCl4)制作肝硬化模型，造模期间饮含100 mL/L乙醇的水溶液，造模期间死亡35只。按Ishak肝纤维化分级评分标准［6］达到肝硬化标准有139只。制模成功后，术前随机抽10只肝硬化大鼠为对照，再随机抽取40、40、20只，分别纳入 A、B、C组。A组参考文献［7～10］行PVA加PCS:利用大鼠右肾动脉、静脉实现入肝门脉动脉化及门腔分流;B组只行PCS，采用门脉远端与右肾静脉吻合，近端门脉缝闭;C组为空白对照，仅行门脉阻断+右肾切除，阻断门脉时间依据A、B组动物阻断门脉的平均时间，阻断持续30 min。

1.2 肝组织iNOS表达检测 术前及A、B组术后1、2、4、8周分别处死10只大鼠、C组术后相同时间点各处死5只大鼠。取肝脏组织，采用免疫组化SP法检测肝细胞中的iNOS。光镜下观察iNOS阳性细胞胞质呈棕黄色，每张切片选取四周及中央5个区域，采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件分析图片胞质棕黄色颗粒面积、平均光密度(MOD)及累积光密度 (IOD，面积×平均光密度)，5张照片取均数，代表iNOS表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，检验数据的正态性和方差齐性符合条件后，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用LSD检验;计量资料比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

三组术后各时点iNOS表达水平均低于术前(P均 ＜0.05)。A 组术后1、2、4 周 iONS表达高于 B、C组(P均＜0.01)，而术后8周，三组iNOS表达差异无统计学意义(见表1)。三组术前及术后不同时点iNOS表达变化趋势见图1。

3 讨论

研究表明，PVA+PCS可显著改善肝硬化大鼠肝功能及储备功能，促进肝硬化大鼠肝组织细胞再生、增殖［9～12］，稳定入肝门静脉的动脉血流［13，14］，在肝硬化门静脉高压症的治疗方面具有明显优势，同时对于肝移植、急性肝功能衰竭、手术难以切除肝门部肿瘤的手术治疗也有广阔的应用前景［15，16］。但目前也发现该技术存在的一些问题，如长期未加限流措施的动脉化可能导致肝脏实质结构改变，包括门脉内膜纤维化，肝实质纤维化，原因可能与肝脏前胶原蛋白ⅠmRNA表达上调，翻译合成胶原蛋白增加有关［1，2］。

表1 各组肝组织iNOS相对表达量比较(±s)

表1 各组肝组织iNOS相对表达量比较(±s)

注:与术前相比，*P ＜0.05;与 A组同期相比，#P ＜0.01

组别 n iNOS A 组术前 10 600 583±32 828术后1周 10 560 372±35 878*术后2周 10 247 237±31 738*术后4周 10 407 727±39 964*术后8周 10 413 169±37 522*B组术前 10 600 583±32 828术后1周 10 221 381±39 341*#术后2周 10 271 642±37 357*#术后4周 10 383 416±37 588*#术后8周 10 354 977±37 586*C组术前 10 600 583±32 828术后1周 5 258 247±40 565*#术后2周 5 209 783±36 796*术后4周 5 321 239±39 596*#术后8周 5 287 126±30 730*

图1 各组手术前后肝组织中iNOS表达变化趋势(400×)

NOS至少有三种亚型，分别为eNOS、神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和iNOS。肝脏内主要存在eNOS和iNOS两种类型，eNOS存在于肝内血管和血窦内皮细胞中;iNOS则表达于肝细胞、Kupffer细胞和肝星状细胞。在正常情况下，肝组织中主要表达eNOS，在许多物质如内毒素(LPS)、肿瘤坏死因了(TNF)及干扰素lp(IFN-lp)等细胞因子刺激后，iNOS呈诱导性表达增加，其活性可持续相当长时间，催化 NO大量持续产生，介导广泛的毒性作用［1，2］。在氧化应激造成的肝损伤中，iNOS的表达水平与肝细胞坏死程度呈正相关，提示iNOS的活化及表达增强与肝脏损伤有关［4］。

我们建立了肝硬化大鼠模型，并采取不同措施处理，结果发现，各组大鼠术后肝组织中iNOS水平均低于术前造模成功时，提示iNOS高表达参与了肝硬化的形成。各组大鼠术后，随时间推移，iNOS表达逐步下降，但A组下降幅度均B、C组缓慢，术后1～4周仍高于余两组，至术后8周，三组iNOS表达达到谷值，组间差异无统计学意义。推测PVA技术是术后4周内A组大鼠肝组织iNOS高表达或下降缓慢的主要因素，与大鼠肝细胞损害密切相关。可能是PVA后，门静脉处动脉血高压灌注，为缓和PVA后的门脉高压，有舒张血管平滑肌作用的化学分子如NO合成增加，而iNOS是合成NO重要的酶;而术后8周大鼠肝脏对PVA导致的血流动力学改变逐渐适应，PVA后门静脉内径、压力、血流速度、血流量等指标处于高位的稳定状态，iNOS生成减少，肝细胞损伤逐渐减轻。NO具有脂溶性，可直接弥散入邻近血管平滑肌细胞中，引起血管平滑肌舒张，扩张血管，这一点与大鼠PVA后肝脏血流动力学的自限稳定性密切相关［12，13］。

综上，PVA+PCS可上调肝硬化大鼠肝脏组织中iNOS的水平，但这种变化主要集中在术后4周内。4周后，肝脏对新的血流动力学改变适应并达到稳态，PVA造成的肝损害得到缓解。然而，本实验结果还需远期观察进一步证实，PVA术后还应观察门静脉长期高压血流灌注对肝脏微循环的不利影响，对肝间质纤维增生的影响等，并研究相应的预防控制措施。

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