远志及其近缘种的ITS序列分析及鉴定

樊 杰，白 妍，束明月

（山西中医学院，山西太原 030024）

远志属是一个世界性分布的大属，尤以热带、亚热带为盛，约500种［1］。我国远志属有42种8变种，全国分布，以西南和华南地区最多［1-2］。远志属植物含有丰富的三萜皂苷、口山酮、寡糖酯类成分及其他活性成分，组成该属植物生理活性的有效物质群，具有镇咳、祛痰、益智、安定、解毒消肿、补益强壮等作用［3-4］。在临床和民间常用于心神不安、惊悸、失眠健忘、咳痰不爽、疮疡肿毒等。其中，远志和卵叶远志是中药远志的基源植物［5］，二者从植物形态到药材鉴定均不易区别［6］。瓜子金在外部形态上与这2个种非常类似，但化学成分略有不同［3］。核糖体DNA内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列在药用植物的分子鉴定、遗传多样性等方面有大量研究［7-8］，本研究通过测定ITS序列，分析卵叶远志、远志和瓜子金的差异，为这3种药用植物的分子鉴定，为药材远志基源植物的选择提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

远志采自山西灵丘，常温下自然干燥并保存1年；从Genbank数据库获得另外2个种的2条ITS序列和远志的另外2条ITS序列，结果见表1。

1.2 DNA的提取方法

DNA的制备采用改良CTAB法［9］，略作改动，具体为：称取约0.1g叶片，在提前-20℃预冷的研钵中研磨成粉末后用于DNA的提取。水浴温度45℃，水浴5～6h，加异丙醇沉淀1h。

表1 样品来源及ITS序列信息

1.3 PCR扩增及测序

ITS片段均无法1次完成PCR扩增，所以分为ITS1和ITS22段扩增，引物参考文献［10］中的引物，使用的引物包括 ITS forward：5′-cga gaa gtc cac tga acc tta tc-3′，ITS reverse：P1：5′-tct tyt cct ccg ctt att gat atgc-3′和 ITS internal reverse：5′-gcg ttc aaa gac tcg atg gtt c-3′，ITS internal forward：5′-gac tct cgg caa cgg ata tct cggc-3′。PCR反应在 PTC-200型PCR仪上进行。PCR总体积为25μL，包括：12.5μL Mix（Takara Premix Taq），10μm 引物各 0.5μL，0.5～1μL 模板（10～50ng），用灭菌超纯水补足反应体积。扩增程序为：94℃，3min；33个循环：94℃，1min；58℃，1min；72℃，1min 20s；72℃，6min。PCR 产物10μL用1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送华大基因测序。

1.4 序列提交与分析

序列通过Sequin软件提交至NCBI数据库，并获得相应登录号。ClustalX 1.81软件用于序列比对，采用MEGA 3.1软件计算遗传距离并构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 ITS序列比较

测序结果表明，序列中除ITS1和ITS2的全长外，还包含5.8S、18S和28S的部分序列，远志的ITS序列已提交至NCBI，Genbank登录号见表1。序列分析结果表明，远志属3种药用植物ITS1长度为269～271bp，G＋C 量为 63.1%～63.4%；ITS2的长度为216～217bp，G＋C 量为64.4%～65.0%。结果见表2。

表2 远志属3种药用植物ITS序列长度和G+C含量

2.2 系统发育分析

利用MEGA 3.1软件计算ITS的变异位点及信息位点，结果表明，5.8S基因无变异；ITS1序列有19个变异位点，占总位点数的6.76%，其中17个是由于瓜子金单碱基突变造成的，另2个是由于山西灵丘的远志样品单碱基缺少造成的，无信息位点，Genbank下载的2个远志序列与卵叶远志序列无差异；ITS2序列有7个变异位点，占总位点数的3.02%，其中6个为瓜子金的单碱基变异造成的，信息位点仅1个，山西灵丘远志有1个单碱基缺失，卵叶远志序列和Genbank下载的2个远志序列完全一致。

利用MEGA 3.1的Kimura 2-parameter计算3种药用植物之间的遗传距离。结果表明，瓜子金与其他2个种的距离最远，均为0.038；其次为山西灵丘远志样品；远志来自Genbank的2个样品与卵叶远志之间的遗传距离最小，为0.000，关系最近（表3）。

表3 远志属3种药用植物的遗传距离

基于ITS序列，采用NJ法构建了系统发育树（图1），经1000次自举检测，结果表明，远志的3个样品分为2支，Genbank的2个样品与卵叶远志聚为1支，山西灵丘远志样品单独为1支，瓜子金单独为1支。

图1 基于ITS序列构建的系统发育树

3 讨论

山西灵丘远志样品和另外2个来自Genbank的样品存在遗传差异性，说明远志存在种下变异。已有的ISSR研究发现，远志不同居群之间存在遗传差异性，这在一定程度上佐证了我们的结论［7，11］。

ITS序列分析技术具有技术简单、结果准确、重复性好等优点，近年来广泛应用于药用植物鉴定，是药学研究中的一种重要分子标记［12］。其中ITS2被认为比ITS1具有更多的信息位点，具有更高的鉴定效率［13］。我们的研究支持这一观点，ITS1含有19个变异位点，占总位点数的6.76%，但无信息位点；ITS2序列存在7个变异位点，占总位点数的3.02%，有1个信息位点。

卵叶远志和远志同为药材远志的基源植物［5］，两者在形态上十分相似，药材也较难区别［6］。通过比较它们的ITS序列，发现卵叶远志和2个Genbank下载的远志序列无差异，但与山西灵丘远志存在差异，这与形态特征是一致的。

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