石斛合剂对老年糖尿病大鼠GCK、GLUT-2的影响

刘 赟，施 红，林心君，郑晓玲，许 茜

（福建中医药大学，福建福州 350122）

哺乳动物体内已发现四种己糖激酶同工酶，在肝脏中存在的是IV型，称为葡萄糖激酶（GCK），是肝脏葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖步骤的限速酶［1］。GCK影响β细胞胰岛素的合成和分泌，充当刺激胰岛素分泌的葡萄糖感受器，在维持体内葡萄糖平衡中起到关键性的作用［2］。另外，有人提出糖尿病发病的“葡萄糖调定点”学说，认为葡萄糖转运蛋白-2（GLUT-2）和GCK的缺陷使β细胞对细胞外的葡萄糖敏感性降低，即β细胞膜胰岛素释放的“调定点”提高了［3］。本研究通过检测大鼠胰岛细胞GCK、GLUT-2水平，探讨石斛合剂（DC）治疗糖尿病可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物与试剂 石斛、黄芪、五味子、丹参、葛根、玄参等；二甲双胍缓释片。

1.1.2 实验动物 健康SPF级Wistar大鼠70只，6月龄，雌性，体重（250±30）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。

1.1.3 实验仪器 乐康全微量血糖检测仪及血糖试纸，武汉俊杰电子有限公司生物组织摊烤片机（JK-5型），德国Leica公司石蜡切片机（RM2245型），日立7180自动生化分析仪等。

1.2 实验方法

Wistar大鼠适应性喂养7d，随机分为两组：正常组15只、造模组55只。根据课题组前期工作研究，正常组给予基础饲料（来自福建中医药大学实验动物中心）喂养，造模组给予高脂高糖饲料（自备：糖15%，猪油10%，胆固醇4%，胆盐0.3%，蛋黄粉10%，基础饲料60.7%），持续喂养1年（自然死亡15只）。造模组腹腔注射低剂量的STZ（20mg/kg），3d后用微量血糖仪筛选出随机血糖≥16.7mmol/L者为成模，其余不成模大鼠腹腔注射低剂量的STZ（20mg/kg），3d后用微量血糖仪筛选出成模大鼠。将2次成模大鼠随机分为模型组（12只）、石斛合剂低剂量组（12只）、石斛合剂高剂量组（12只）、二甲双胍对照组（10只），石斛合剂低、高剂量组灌胃生药含量分别为2.0g/mL、4.0g/mL。检测血糖、GSP，取胰腺组织，免疫组化检测GLUT-2、GCK。

1.3 统计学方法

用计算机统计软件SPSS17.0进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示。

2 结果

2.1 石斛合剂对大鼠血清血糖、GSP水平的影响

模型组血糖水平、GSP水平显著高于正常组（P＜0.01）；与模型组比较，石斛合剂低剂量组、高剂量血糖水平、GSP 水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01），二甲双胍对照组血糖水平显著降低（P＜0.05）。结果见表1。

表1 大鼠血糖、GSP水平的比较 （mmol/L，±s）

表1 大鼠血糖、GSP水平的比较 （mmol/L，±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01

组别 n 血糖（己糖激酶法）血糖（血糖仪法） G S P水平正常组 9 5.352±0.181 5.450±0.2061.201±0.049模型组 12 19.224±1.8171） 21.450±2.1641） 1.875±0.8831）二甲双胍对照组 10 15.568±0.3462） 16.681±0.6542） 1.667±0.068石斛合剂低剂量组 12 11.652±0.4923） 12.133±0.8983） 1.568±0.0422）石斛合剂高剂量组 12 8.478±0.3033） 9.000±0.5513） 1.427±0.0573）

2.2 石斛合剂对大鼠GCK水平的影响

正常组在胰岛和腺泡可见到GCK阳性表达，胰岛内细胞染色较均匀且颜色较深，空泡较少；模型组胰岛形态改变，边界不清，在胰岛和腺泡可见到GCK阳性表达，但岛内出现空泡，胰岛内细胞染色不均匀且颜色较浅，部分细胞核呈梭形，细胞形状不规则；二甲双胍对照组在胰岛和腺泡可见到GCK阳性表达，岛内出现部分空泡，胰岛内染色不均匀，部分染色较深；低剂量组在胰岛和腺泡可见到GCK阳性表达，染色较模型组深，岛内出现部分空泡；高剂量组胰岛边界清晰，在胰岛和腺泡可见到GCK阳性表达，染色较模型组深，可见部分空泡。统计表明：模型组GCK阳性面积、积分光密度（IOD）显著低于正常组（P＜0.01），高、低剂量组GCK 阳性面积、IOD 显著高于模型组（P＜0.05）。结果见表 2、图 1。

表2 大鼠胰岛GCK面积、IOD的比较 （±s）

表2 大鼠胰岛GCK面积、IOD的比较 （±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05

组别 n 面积（像素） IOD正常组 9 2627.500±204.527 1874.000±357.660模型组 12 737.000±60.9291） 319.667±21.7941）二甲双胍对照组 10 753.167±56.108 302.500±20.322石斛合剂低剂量组 12 1247.500±129.7602） 503.500±44.1992）石斛合剂高剂量组 12 1217.167±133.1032） 457.667±29.4472）

2.3 石斛合剂对大鼠GLUT-2水平的影响

正常组在胰岛和腺泡可见到阳性表达，胰岛内细胞染色较均匀且颜色较深，空泡较少；模型组胰岛形态改变，边界不清，在胰岛和腺泡可见到阳性表达，但岛内出现空泡，部分细胞核呈梭形，细胞形状不规则；二甲双胍对照组在胰岛和腺泡可见到阳性表达，胰岛边界不清，部分染色较深，部分细胞核呈梭形；低剂量组在胰岛和腺泡可见到阳性表达，且染色较均匀，岛内出现部分空泡；高剂量组在胰岛和腺泡可见到阳性表达，且染色较均匀，空泡较少。统计表明：模型组GLUT-2阳性面积、IOD显著低于正常组（P＜0.01），低、高剂量组 GLUT-2阳性面积、IOD 显著高于模型组（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表 3、图2。

3 讨论

图1 胰腺GCK免疫组化

图2 胰腺GLUT-2免疫组化

表3 大鼠胰岛GLUT-2面积、IOD的比较 （±s）

表3 大鼠胰岛GLUT-2面积、IOD的比较 （±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01

组别 n 面积（像素） I O D正常组 913430.167±1687.8681665.000±148.657模型组 124666.333±772.1071） 421.833±46.4781）二甲双胍对照组 103188.667±411.536 542.333±68.373石斛合剂低剂量组 129160.667±372.8082） 1425.500±208.6623）石斛合剂高剂量组 1214370.667±2886.4323） 1336.333±233.4753）

通过以往的研究发现，石斛合剂可降低血糖、提升大鼠GLP-1含量［4-5］。另有研究表明GLP-1能促进胰腺转录因子及葡萄糖激酶（GK）、GLUT-2的基因表达，改善糖脂毒性对β细胞功能的影响，抑制β细胞凋亡［6］。高血糖可下调葡萄糖通过膜上的GlUT-2在β细胞中的表达，从而减少糖的转运，使胰岛素分泌减少。

本实验用免疫组化方法检测GCK，高、低剂量组GCK阳性面积及IOD显著高于模型组，说明石斛合剂能保护胰岛细胞，并促进部分胰岛细胞分泌GCK，从而起到一定的代偿作用；高、低剂量组GLUT-2阳性面积、IOD显著高于模型组，说明石斛合剂可以对胰岛起到保护作用，减少胰岛内空泡的形成，从而更好地发挥其分泌的作用。综上所述，石斛合剂的作用机制可能是促进GCK和GLUT-2在胰腺的表达，从而达到治疗糖尿病的目的。

［1］Matschinsky F M.Glucokinase，glucose homeostasis，and diabetes mellitus［J］.Curt Diab Rep，2005，5（3）：171-176.

［2］翁建甲，黄知敏.早发型糖尿病的研究进展［J］.广东医学杂志，2003，24（2）：126-127.

［3］Gammeltoft S，Kahn C R.Hormone signaling via membanae receptors［M］∥Larry Jameson J，De Groot L J.Endocrinology.3rd.Philadelphia：Saunders，1955：17-65.

［4］施红，林求诚，陈国强，等.石斛合剂对2型糖尿病的临床疗效观察［J］.中药新药与临床药理，2002，13（6）：348-350.

［5］余文珍，施红，郑燕芳，等.石斛合剂对衰老糖尿病大鼠血清GLP-1水平的影响［J］.海南医学院学报，2006，12（3）：196-199.

［6］Federici M，Hribal W，Perego L，et al.High glucose causes apoptosis in cultured human pancreatic islets of langerhans［J］.Diabetes，2001，50（6）：1290.