小鼠骨髓树突状细胞体外培养扩增与生物学特性研究

刘晓玲，郭红月，董 猛，宋振川

(河北省沧州中西医结合医院，河北沧州061001)

树突状细胞(dendritic cell，DC)是抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC)，也是唯一能将抗原递呈给初始T细胞激发初次免疫应答的抗原呈提细胞，被认为是机体免疫的始动者，在抗肿瘤免疫方面发挥着重要作用，基于DC的免疫治疗被认为是最具前景的抗肿瘤治疗［1］，本研究采用简便方法体外分离培养扩增小鼠骨髓DCs，为抗肿瘤疫苗的实验研究奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料

SPF级615小鼠，雌雄各半，鼠龄6～8周龄，体重17～21g，购于天津中国医学科学院血液研究所实验动物中心。胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)、RPMI1640培养基(美国GIBICO公司)、PBS粉(北京中杉金桥生物技术有限公司)rmIl-4、rmGMCSF、rmTNF-α、FITC 标记抗鼠单克隆抗体、PE 标记抗鼠CD86单克隆抗体均购于美国BioLegend公司。CO2培养箱(美国 SHELDON)、流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)、倒置显微镜(日本OLYMPUS)。

1．2 实验方法

1．2．1 小鼠骨髓单核细胞分离 将615小鼠拉颈处死，浸入75%酒精消毒5min，无菌状态下取胫骨和股骨，剪掉股骨和胫骨骨两端，用1ml一次性使用注射器抽取PBS液，刺入骨髓腔反复冲洗，骨髓细胞悬液过400目滤网去除组织碎片，收集细胞悬液离心(1 500r/min，5min)，弃上清，以1∶10体积比加入37℃预温的红细胞裂解液重悬使红细胞裂解，同法PBS液离心清洗2次。

1．2．2 骨髓源树突状细胞(BMDC)的培养扩增用全培养基悬浮细胞，细胞计数，以RMPI-1640全培养液配成2×106个/ml的细胞悬液，接种于6孔板，每孔中加入完全培养基至4ml，再加入GM-CSF(终质量浓度20ng/ml)，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。第3天轻轻吹打，吸去培养液和悬浮细胞，保留贴壁细胞加入新鲜的等量RMPI-1640全培养液和相同浓度的GM-CSF及终浓度为10ng/ml的IL-4，继续培养，隔日半量换液，补充RMPI-1640全培养液和GM-CSF及IL-4。继续培养至第8天，加入TNF-α(10ng/ml)，孵育48小时收集悬浮细胞即为成熟的DCs。

1．2．3 细胞生长状态观察 每天相差显微镜下观察DC的形态、数量、分布、贴壁情况、细胞集落生长情况并拍照。

1．2．4 DC细胞表型流式细胞术分析 分别收集加入TNF-α前及加入TNF-α 48小时后的DC悬液，离心沉淀(1 000r/min，5min)，去上清，加PBS 4ml悬垂，再离心2次，用PBS缓冲液调整细胞浓度至1 ×106个/ml，加入 Eppendorf管，每管 100μl，然后分别加入 FITC anti-mouseCD11c、Peanti-mouseCD86单抗各2μg，4℃避光孵育30min，PBS液洗3次后用，流式细胞仪检测各组DC表面CD11c、CD86的表达情况，将加入TNF-α前后组作为实验组，未加入抗体的DC组作为对照组，比较其表面标志物的表达。

1．3 统计学方法

所有数据均采用SPSS13．0统计软件分析，DC表型表达阳性率数据分析采用χ2检验，以均数±标准差(±s)表示，以 P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 培养细胞的形态学观察

经分离提纯的小鼠骨髓细胞，培养24小时后相差显微镜下可见培养板底部有半贴壁细胞，少量细胞集落形成，簇状生长，细胞体积小，圆形，细胞无明显突起(图1a);体外培养3天后可见贴壁细胞逐渐增多，松散粘附于培养板的细胞集落增多，散在少量DC，半贴壁，细胞体积有所增大，细胞核可见，为较小圆或椭圆形，可见贴壁的单核巨噬细胞(图1b);第5天可见部分细胞脱壁，从细胞集落中释放出来，呈半贴壁状态，细胞体积变大，形态不规则，有部分突起，即为未成熟DC(图1c～图1e);培养第7天，细胞体积更大，培养液中有更多悬浮细胞，细胞集落散在其中，更加松散，形态趋于特征性星形，有2～5个不等的突起，悬浮细胞为扩增之骨髓树突状细胞(图1f～1g);加入TNF-α 24h后，大量形态典型的DC从集落释放，细胞生长旺盛，体积增大，有明显树枝状突起，突起粗大且长，胞体饱满，呈星形、多边形、或梭行(图1h～1j)。每只615小鼠平均能分离出3×107个骨髓细胞，经培养可获得7×106个DC。

图1 DC培养观察图

2．2 流式细胞仪检测小鼠骨髓DC加入TNF-α前后CD11c及CD86的阳性表达情况

将加入TNF-α前后组作为实验组，将未加抗体的DC作为对照组，结果显示，CD11c阳性表达率加入 TNF-α 前为:(65．09 ±3．04)%(图 2)，加入TNF-α后为:(70．99 ± 1．44)%(图 3)(χ2=6．625;p=0．097);CD86阳性表达率加入 TNF-α 前为(25．80±0．30)%(图 2)，加入 TNF-α 后为(55．91 ±2．41)%(图 3)(χ2=6．856;p=0．032)。CD86 加入TNF-α前阳性表达率低于加入TNF-α后，差异有统计学意义，CD11c的阳性表达率加入TNF-α前后差异无统计学意义(p＞0．05)。见表1。

图2 加入TNF-α前CD11c、CD86阳性表达率

图3 加入TNF-α后CD11c、CD86阳性表达率

表1 流式细胞仪检测树突状细胞CD11c CD86阳性表达率 ［(±s)%］

表1 流式细胞仪检测树突状细胞CD11c CD86阳性表达率 ［(±s)%］

◆组与* 组比较，P ＞0．05(χ2=6．625;p=0．097)▲组与★组比较，P ＜0．05(χ2=6．856;p=0．032)

表面标志物 加入TNF-α前 加入TNF-α后CD11c 65．09 ±3．04◆ 70．99 ±1．44*CD86 25．80 ±0．30▲ 55．91 ±2．41★

3 讨论

树突状细胞是由Steinman和Cohn首先由小鼠脾脏组织中分离发现的，因其具有典型的树突状突起而命名［2］。在接受抗原刺激成熟后，DC可以有效地摄取抗原，并通过抗原肽/MHC分子复合物的形式，将抗原有效提呈给初始T细胞，刺激生成针对该抗原的特异性细胞毒T细胞，从而有效启动机体免疫反应［3］。目前，已能够通过体外抗原冲击、基因转染、细胞融合等方法制备出相应的DCs肿瘤疫苗，并且在动物实验中获得很好的效果［4-6］。

DC主要来源于骨髓的CD34+造血干细胞，故可以从骨髓细胞中分离诱导DC，获得一定量有功能的DC是深入研究其生物学功能的关键，然而DC在体内分布分散，含量极低，在动物和人外周血中尚不足白细胞总量的1%，在实质器官中低于局部细胞1%，在血液中低于有核细胞的0．1%，故如何体外大量扩增DCs成为研究者目前急需解决的问题［7］。

在小鼠DC的体外分离培养扩增中添加细胞因子是最重要的环节，GM-CSF是维持DC发育及分化最根本的细胞因子，但是单一使用GM-CSF只能产生少量的DC集落，并且还会刺激骨髓细胞中的巨噬细胞、中性粒细胞大量增殖，影响DC纯度，而IL-4能抑制培养物中巨噬细胞和中性粒细胞的产生，并能使DC具有典型形态和很强的处理外源性抗原能力［8］。通过联合应用GM-CSF和IL-4进行体外诱导培养至第7天时，加入脂多糖(LPS)继续培养24h，能获得大量成熟 DCs［9］。

在本研究开始，GM-CSF及IL-4浓度配比较低，骨髓细胞生长缓慢，调整GM-CSF浓度至20ng/ml，IL-4浓度至10ng/ml，细胞数量增多，体积增大。本实验在第三天开始加入IL-4，而不是在本实验开始前加入，是考虑IL-4与GM-CSF作用相抵触之处。TNF-α能抑制粒细胞的产生，同时诱导 DC的成熟［10］，可以将成熟的DC数量提高10%～15%。

由于DC来源复杂，到目前为止，还没有发现一种表面分子能够代表不同组织及不同分化时期的所有DC的特异性标记，目前通常采用细胞形态、表型及异基因淋巴细胞刺激能力三者相结合的方法。

据报道33D1、凝集素类似受体 NLDC-k145、DEC-205及整合素CD11c［11］被认为是小鼠DC较特异性的表面标记，在这3种表面分子中，CD11c是相对分子质量为150 000的β2整合素家族成员，髓样树突状细胞表达髓源性抗原CD11c，CD11c是确定DCs特异性表面标志物之一，与CD86相比，包括DC前体、未成熟及活化成熟的DC均有较高的表达率［12］。CD86是细胞表面黏附因子，也是激活T细胞的第2信号分子，可作为DC的活性指标［13］。

不成熟DC具有很强的吞噬、加工处理抗原的能力，但是对T细胞的刺激功能比较低，其表面低表达甚至不表达MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子如CD40、CD80和CD86。未成熟DCs捕获抗原后，并在一些活化因子(如 LPS、IL-1β、TNF-α 等)作用下可分化为成熟DCs，其表面MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子的表达显著上调，其介导的免疫反应增强，对T细胞的刺激功能增加，但抗原摄取能力下降［14］。

本实验流式细胞仪检测表面标志物，经统计学分析，CD11c添加TNF-α前后的阳性表达率无差别，CD86加入TNF-α后阳性表达率较加入 TNF-α前明显增加。说明未成熟DC和成熟DC，CD11c均有较高表达，成熟DC较未成熟DC，CD11c表达无明显增高，说明CD11c是DC的特异性表面标志物，CD86在成熟DC表达较未成熟DC高。说明TNF-α能提高CD34+干细胞表面GM-CSF受体数量，促进细胞表达CD86，阻断粒细胞分化途径，促进DC分化、成熟［15］。

本实验经rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导，可以从小鼠骨髓获得大量具有典型DC形态学特征及生物学特征的树突状细胞，这为DC疫苗的研究及临床应用奠定了基础。

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