高效液相色谱法测定瓜蒌薤白滴丸中乙酸乙酯部位槲皮素的含量及特征图谱

鄢海燕，金 涌

(1.安徽医科大学 药学院，安徽 合肥 230032;2.皖南医学院 药学院，安徽 芜湖 241002)

瓜蒌薤白滴丸是将瓜蒌薤白白酒汤经剂型改造而制得。冠心病、心绞痛等属于祖国医学胸痹的范畴，出自《金匮要略》的瓜蒌薤白白酒汤具有通阳散结，行气祛痰之功效，主治胸痹，是治疗胸阳不振，气滞痰阻所致胸痹证的常用方［1］。在瓜蒌薤白组方中检测到了黄酮类化合物，如槲皮素［2－3］。采用高效液相色谱法测定瓜蒌薤白滴丸乙酸乙酯部位槲皮素的含量，同时以槲皮素为参照峰建立乙酸乙酯部位的特征图谱，可为瓜蒌薤白滴丸质量标准的建立提供理论依据。

1 仪器与试药

岛津LC-20A高效液相色谱仪(含LC-20A真空在线脱气机、LC-20AT四元泵、CTO-10AS柱温箱、SPD-M20A检测器)，槲皮素对照品(中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，纯度≥98%，批号:1206-08219)，甲醇、乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。13批瓜蒌薤白滴丸(自制，原料来源为药店和亳州药材市场)。

2 方法与结果

2.1 溶液制备［4－5］

2.1.1 对照品溶液 精密称取经五氧化二磷减压干燥12 h的槲皮素对照品适量，加15%甲醇制得含槲皮素约100 mg/L的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取瓜蒌薤白滴丸适量(约相当于瓜蒌薤白2 g)，用适量水溶解后，置于分液漏斗中，加入等量的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，回收乙酸乙酯，残渣用10 ml乙腈溶解，得乙酸乙酯部位供试品溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.2 色谱条件［4］色谱柱为 Lichrospher C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，以乙腈-1%H3PO4溶液为流动相，梯度洗脱(1%H3PO4:0～5 min，80%→75%;5～10 min 75% →73%;10～13 min，73% →72%;13～15 min，72%→72%;15～20 min，72% →70%;20～25 min，70%→69%;25 ～30 min，69%→67%;30～35 min，67%→60%;35 ～40 min，60%→55%;40 ～50 min，55%→55%)，流速:1.0 ml/min;柱温30℃;检测波长为360 nm。计算程序:采用MATLAB语言自编程序及梁逸曾教授编制的《计算机辅助相似性评价系统》。

2.3 槲皮素色谱峰的确认 瓜蒌薤白滴丸乙酸乙酯提取物、槲皮素标准品的色谱图，见图1～2。经采用标准品加入法及渐进窗口正交投影分析法对色谱峰匹配［4，6］，见图 3，样品中 14 号峰为槲皮素。

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 ml于 10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度。按2.2项方法取各对照品溶液10 μl进样，以槲皮素进样的质量(μg)作为横坐标X，峰面积积分值为纵坐标Y，绘制标准曲线并回归处理，结果表明，槲皮素在0.10～2.00 μg范围内线性关系良好。回归方程为:y=9 812.2x+2 433.5，相关系数 r=0.999 8。

2.4.2 精密度试验 取对照品溶液重复进样5次(每次 10 μl)，槲皮素峰面积积分值的 RSD为0.67%。

2.4.3 重复性试验 取同一批样品5份，精密称定，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，测定，槲皮素峰面积积分值的RSD为1.90%。

2.4.4 稳定性试验 精密量取同一供试品溶液，在24 h 内按 0、6、12、18、24 h 间隔进样 5 次，供试品中槲皮素峰面积积分值的RSD为1.97%。

图1 瓜蒌薤白滴丸乙酸乙酯部位HPLC特征图谱Fig 1 HPLC characteristic spectrum of ethyl acetate extraction in Gualou Xiebai pills

图2 槲皮素标准品的HPLC图谱Fig 2 HPLC spectrum of quercetin standard reference

图3 槲皮素标准品与瓜蒌薤白滴丸乙酸乙酯部位特征图谱正交投影前后光谱矢量夹角余弦图Fig 3 Chart of vector angle's cosine before and after orthogonal projection on characteristic spectrum between quercetin standard reference and ethyl acetate extraction in Gualou Xiebai pills

2.4.5 回收率试验 精密称取2.0 g已知槲皮素含量的样品6份，分别加入槲皮素对照品适量，按2.2方法操作，依法测定，计算回收率，结果见表1。

2.5 样品含量测定 按2.2方法，测定13批瓜蒌薤白滴丸样品，结果见表2。

2.6 瓜蒌薤白滴丸乙酸乙酯部位HPLC特征图谱构建

2.6.1 特征图谱的测定 根据13批次供试品测定结果，瓜蒌薤白滴丸乙酸乙酯部位高效液相色谱可分离出50多个色谱峰，经谱峰识别窗口(峰面积/所有峰面积的加和≥0.005)筛选，得到共有峰图谱，如图1。13批样品的特征图谱见图4。

表1 瓜蒌薤白滴丸样品中槲皮素的加样回收率试验结果Tab 1 The average recovery rate of the quercetin in Gualou Xiebai pills

表2 样品测定结果Tab 2 Testing results of the samples

图4 13批样品的特征图谱Fig 4 Characteristic spectrum for the samples of 13 batches

图5 共有模式图谱Fig 5 Spectrum of the common pattern

2.6.2 共有峰的指定 上述指纹图谱中，以槲皮素峰为参比峰，将其保留时间设置为1.00，标定的共有峰(相对保留时间)顺序如下:1(0.11)，2(0.31)，3(0.33)，4(0.36)，5(0.38)，6(0.44)，7(0.52)，8(0.54)，9(0.58)，10(0.60)，11(0.81)，12(0.87)，13(0.97)，14(1.00)，15(1.02)，16(1.12)，17(1.35)，18(1.37)，19(1.41)，20(1.43)，21(1.54)，22(1.60)。

2.6.3 指纹图谱相似度的计算 分别以13批样品指纹图谱共有峰峰面积的均值和中位数建立对照模板，如图5。利用相关系数法和夹角余弦法计算指纹图谱的相似度，2种方法计算的相似度结果见表3。

表3 相似度计算结果Tab 3 Results of similarity calculation

3 讨论

有关文献对于瓜蒌仁的定量一般采用以其中的3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇为指标［7，9］，但由于该标准品的价格较贵且其单体非常不稳定，而槲皮素又为瓜蒌薤白乙酸乙酯提取物中的药效成分［2－3］，因此本实验采用以槲皮素为定量指标，建立了含量测定方法。槲皮素标准品易得，成分稳定，方法精密度、稳定性和重复性均较好，可作为瓜蒌薤白滴丸质量控制方法之一。

中药指纹图谱作为天然药物的质量控制方法目前在国内外已被广泛接受［10］。美国药典、英国药典、印度药典及WHO草药评价指南均收载了指纹图谱［11］。在已有研究基础的中药注射剂、口服固体制剂和提取物等的质量标准中，《中国药典》2010版首次采用指纹图谱或特征图谱技术控制产品质量，体现了中药多靶点作用的特性。为此，我们建立了瓜蒌薤白滴丸乙酸乙酯部位HPLC特征图谱，取共有峰的均值和中位数，利用相关系数法计算平均相似度，分别为0.888 4和0.873 9;利用夹角余弦法计算相度，分别为0.921 7和0.913 1。利用该特征图谱可从整体性上控制瓜蒌薤白滴丸的质量。

本实验对13批瓜蒌薤白滴丸中的槲皮素成分进行了含量测定，平均值为0.014%，RSD为10.2%。从图4也可以直观地看出，13批样品的色谱峰的峰面积或峰高不完全一致，反映出不同产地的瓜蒌、薤白原料对产品内在质量有一定的影响。因此，应按照GAP要求规范管理瓜蒌、薤白药材种植以确保瓜蒌薤白滴丸质量的一致性。

［1］李明明，黄芳，韩林涛，等.瓜蒌薤白白酒汤对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(16):182－186.

［2］何祥久，王乃利，邱峰，等.瓜蒌薤白白酒汤活性成分研究(Ⅲ):黄酮类活性成分［J］.中国中药杂志，2003，28(5):420 －423.

［3］鄢海燕，邹纯才.瓜蒌薤白颗粒中总黄酮的含量测定［J］.皖南医学院学报，2012，31(6):444 －446.

［4］鄢海燕，邹纯才.瓜蒌薤白颗粒的高效液相色谱特征图谱及与组方药味的研究［J］.中国医院药学杂志，2013，33(4):276－280.

［5］鄢海燕，邹纯才，朱磊，等.瓜蒌薤白正丁醇部位腺苷含量及特征图谱［J］.皖南医学院学报，2013，32(2):101 －103.

［6］邹纯才，鄢海燕，方洪壮.渐进窗口正交投影分析法用于决明子色谱指纹图谱峰的匹配［J］.中国中药杂志，2009，34(22):2876－2879.

［7］国家药典委员会.中国药典(2010年版一部).北京:中国医药科技出版社，2010:104.

［8］程雪梅，吴弢，侴桂新，等.RP-HPLC法测定瓜蒌子中3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇含量［J］.药物分析杂志，2005，25(4):377－380.

［9］杨晓颖.气相色谱法 (GC)测定瓜蒌子中3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇的含量［J］.当代医学，2012，28(24):26 －27.

［10］邹纯才，鄢海燕.中药指纹图谱及其数字化［M］.合肥:安徽科学技术出版社，2008:15.

［11］杭太俊.药物分析［M］.7版.北京:人民卫生出版社，2011:520.