美国药典、中国药典、英国药典热原检测方法的比较

方菁嶷 梁羽 李新寅

热原(pyrogen)系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。热原检测方法有两种, 分别是家兔法和内毒素检测法。家兔法系将一定剂量的供试品, 静脉注入家兔体内, 在规定时间内, 观察家兔体温升高的情况, 以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定的一种方法。内毒素法是通过鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素的方法, 此法虽然简单、快速但对内毒素以外的热原不灵敏。因此家兔法是一种重要的不可替代的热原检测方法。美国药典、中国药典、英国药典对家兔热原检测方法都有详细阐述, 为了了解三种方法的区别, 作者用这三种方法对同一款产品进行了检测和评价。

1 试验材料

试验样品：某公司生产的生理盐水；试验动物：新西兰纯种大白兔；动物来源：苏州高新区镇湖实验动物科技有限公司 SCXK(苏)2013-0002；饲料：实验兔全价颗粒饲料(无锡实验动物厂)；水：自来水(符合GB 5749-2006卫生标准)；室温：17～25℃；相对湿度：40%～70%；光照:每天需要12小时光照(全光谱日光灯)；选择健康未使用过的动物；人员：有相应检测资质的检测人员。

2 试验步骤

2.1 动物选择

2.1.1 英国药典：试验前2 d预测体温, 自耳缘静脉注入38.5℃的无热原生理盐水, 剂量10 ml/kg；从注射前至少90 min开始每隔30 min测量体温1次, 直至注射后3 h；体温变化不超过0.6℃可以用于实验。

2.1.2 中国药典：试验前3 d预测体温；每隔30 min测量体温1次, 共测8次；8次体温均在38.0～39.6℃的范围内,且单个兔最高与最低体温相差不超过0.4℃可以用于试验。

2.1.3 美国药典：试验前3 d预测体温；每隔30 min测量体温1次, 共测8次；8次体温均未超过39.8℃可以用于试验。

2.2 基础体温确定

2.2.1 英国药典：在开始注射前40 min 内, 每隔30 min测量体温1 次, 共测量2 次, 确定初始温度的2次测量温差不超过0.2℃；以此2次体温的平均值作为该兔的初始体温；组内动物体温差异≤1℃, 初始体温均在38.0～39.8℃之间可继续试验。

2.2.2 中国药典：每隔30 min测量体温1 次, 测量2 次,2次体温之差不得超过0.2℃, 以此2次体温的平均值作为该兔的正常体温；组内动物体温差异≤1℃, 体温均在38.0～39.6℃之间可继续试验。

2.2.3 美国药典：每隔30 min测量体温1 次, 测量2 次, 以此2次体温的平均值作为该兔的正常体温。组内动物体温差异≤1℃, 体温均不超过39.8℃, 继续试验。

2.3 给药

2.3.1 英国药典：在4 min内自耳缘静脉注入38.5℃的试验样品溶液, 剂量10 ml/kg, 从注射前100 min开始每隔30 min测量体温1次, 直至注射后3 h。

2.3.2 中国药典：测量正常体温15 min以内自耳缘静脉注入规定剂量(10 ml/kg)并温热至38℃的试验样品, 然后每隔30 min测量其体温1次。

2.3.3 美国药典：在10 min内自耳缘静脉注入温热至(37±2)℃的试验样品, 剂量10 ml/kg, 然后每隔30 min测量其体温1次。

2.4 确定体温升高数

2.4.1 英国药典：注射后3 h内最高的1次体温减去初始体温, 即为该兔体温的变化数(℃)。

2.4.2 中国药典：同英国药典。

2.4.3 美国药典：同英国药典。

2.5 判定标准

2.5.1 英国药典：当试验兔变化为负值时以0℃计；用3只兔子进行实验, 必要时加测3只, 总数不超过四批共计12只；对应实验动物数, 如果体温上升总和不超过表1第2列,结果可接受；对应实验动物数, 如果体温上升总和大于表1第2列, 但小于表1第3列, 按要求加测；对应实验动物数,如果体温上升总和大于表1第3列, 该实验样品未通过热原试验。见表1。

2.5.2 中国药典：当试验兔变化为负值时以0℃计；在初试的3只试验兔中, 体温升高均低于0.6℃, 并且3只试验兔

体温升高总和低于1.3℃, 符合规定, 否则需进行复试；在复试的5只试验兔中, 体温升高0.6℃或0.6℃以上的试验兔不超过1只, 并且初试、复试合并8只试验兔的体温升高总和为3.5℃或3.5℃以下, 判试验样品的热原检查符合规定, 否则不符合规定。

2.5.3 美国药典：当试验兔变化为负值时以0℃计；初试的3只试验兔中, 体温升高均低于0.5℃；初试时任一动物体温升高均超过0.5℃, 则选择5只试验动物复试, 在试验的8只兔中, 体温升高0.5℃或0.5℃以上的试验兔不超过3只,并且8只试验兔的体温升高总和≤3.3℃, 判试验样品的热原检查符合规定, 否则不符合规定。

3 结果

3.1 英国药典试验结果, 见表2。

3.2 中国药典试验结果, 见表3。

3.3 美国药典试验结果, 见表4。

表1 评价标准

表2 英国药典试验结果

表3 中国药典试验结果

表4 美国药典试验结果

3.4 结果分析

3.4.1 英国药典：3只试验兔体温变化总和超过1.15℃, 需要复测或判为不符合英国药典要求。

3.4.2 中国药典：3只试验兔体温变化总和<1.3℃, 并且体温升高均低于0.6℃, 判符合中国药典要求。

3.4.3 美国药典：单个试验兔体温升高达到0.5℃, 需要复测或判为不符合美国药典要求。

4 讨论

从试验方法分析, 在动物选择方面, 英国药典预测体温前需注射无热原生理盐水, 而中国药典和美国药典只需直接测量, 前者共测量10次, 后两者只需测8次, 明显英国药典在动物选择方面要求高的多；后两者相比, 中国药典又要比美国药典要求高, 因为中国药典规定了允许的体温区间38.0～39.6℃, 并且单个兔最高与最低体温相差不超过0.4℃,而美国药典仅要求8次体温均未超过39.8℃即可。在基础体温确定方面, 三个方法的要求基本一致；但中国药典在允许的体温区间要求方面比美国药典要高。英国药典规定的给药速度快, 供试品的温度高；美国药典对供试品温度的要求相对可操作性强一点, 规定了(37±2)℃的区间, 而且给药速度也较慢。确定体温升高数方面三种方法一致。英国药典的判定标准最复杂, 加测的机会也多, 共计可以检测到12只兔子, 但没有规定单个兔子体温升高的限值；中国药典和美国药典都给出了单个兔子体温升高的限值, 但前者比后者宽松0.1℃, 复测后体温升高总数限值前者比后者宽松0.2℃；但值得一提的是初始的3只兔子体温升高总数限值英国药典要求最高, 要求不超过1.15℃, 中国药典要求不超过1.3℃, 而美国药典只规定单个试验兔的体温升高上限, 就这一点来说英国药典要求是最高的。

从结果分析, 发现表1虽然不符合英国药典的要求, 但符合中国药典和美国药典的要求；表2符合中国药典的要求但不符合美国药典及英国药典的要求；表3不符合美国药典的要求但符合中国药典的要求。也就是说同一款产品用不同的药典方法做检测完全有可能得到不同的结论。

综上所述, 不同的药典试验方法虽大同小异, 但动物入选、给药方式、判定标准的差异完全有可能导致同一款产品按照不同的药典方法得出不同的结果, 要根据试验样品的来源、使用人群、销售途径等谨慎选择试验方法。

［1］British Pharmacopoeia Commission Office.BP2007.London: The Stationery Office, 2007 (Appendix XIV D):359.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部).北京: 化学工业出版社, 2010:附录XI.

［3］The united states Pharmacopeial convention.USP 2003, U.S.A.:United Stated Pharmacopeial Convention, 2003:USP34-NF29.