30味中药提取物与环丙沙星联用对猪源链球菌体外抑菌作用研究

宋晓言，赵 晴，田立杰，刘树明，马红霞*

(吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118)

猪源链球菌是一种重要的人畜共患病病原，主要致病型以II型，属于D血清群。可引发人和动物的多种化脓性疾病、肺炎、乳腺炎、败血症等，给人畜健康均带来极大危害［1］。近年来，随着抗生素不合理应用，猪源链球菌出现不同程度的耐药性，不但给我国养猪业造成严重的经济损失，也给我国公共卫生事业带来极大威胁［2］。因此，研发一种天然、绿色、无毒、低副作用的抗菌药物增效剂迫在眉睫。

中药作为我国的优势国药，被喻为“天然抗生素”，其资源丰富，品种较多、成分复杂毒副作用小、易于代谢。近年来，从中药中研发新药倍受重视，其中，中药与抗菌药物联用防治畜禽疾病为重要组成部分，其发挥的作用已引起广泛关注［3－4］。清热解毒、祛风除湿类等中药的抑菌作用较强，试验选取具有此类功效的30味中药提取物分别与环丙沙星进行联合药敏试验，旨在检测环丙沙星与其合用对猪源链球菌的联合体外抑菌效果，初步追踪有协同抑菌作用中药萃取物的抑菌效果，为兽医临床合理用药及进一步分析中药活性成分奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株 链球菌药敏质控株CVCC3077，购自中国兽医药品监察所微生物菌种保藏管理中心。

猪源多重耐药链球菌(pf－cc)，于2011年采自吉林省某猪场病死猪的病变肺脏，由吉林农业大学药理试验室保存，文献报道pf－cc对环丙沙星、青霉素、红霉素、克林霉素、多西环素、氟苯尼考的最低抑菌浓度值(MIC值)分别为256、1、﹥512、﹥512、64 和128 μg/mL，而 CVCC3307 对环丙沙星、青霉素、红霉素、克林霉素、多西环素、氟苯尼考的MIC值分别为 1、≤0.03、0.03、0.06、0.25 和 2 μg/mL［5］。

1.2 药物 佩兰、黄连、郁金、枳壳、苍术、射干、辛夷、艾叶、麦冬、菊花、木通、厚朴、地龙、赤芍、白芍、白芷、虎杖、青蒿、防风、苦参、山豆根、土茯苓、金钱草、刺五加、鱼腥草、紫花地丁、马齿苋、天花粉、女贞子，决明子共30味中药均购于吉林省长春市福百草大药房。

乳酸环丙沙星(CIP)原粉由北京海洋医化生物科技有限公司惠赠。

1.3 培养基的配制 链球菌血琼脂培养基按照参考文献进行配制［6］。

1.4 菌种复苏纯化鉴定及菌落计数 无菌环境下，用接种环蘸取已鉴定保存菌液于血琼脂平板上划线，37℃恒温培养箱中静置培养18～24 h［7］，挑取形态、大小均匀的单个典型菌落于链球菌液体培养液中，37℃震荡培养18～24 h，经鉴定为链球菌，并按照常规方法进行菌落计数［8］。

1.5 药物制备

1.5.1 中药水提物的制备 精确称取所选30味中药各50 g，加蒸馏水2000 mL，加热至沸腾后，文火煎煮三次，每次0.5 h。分别合并三次滤液，浓缩至1/2体积后，离心、过滤、浓缩为1 g/mL，灭菌后4℃保存备用。

1.5.2 中药醇提物的制备 精确称取所选30味中药各50 g，将其粉碎至粉末状，用75%乙醇按料液比为1∶8比例浸泡12 h，25 ℃超声提取三次，0.5 h/次。分别合并醇提液，挥去乙醇、浓缩为1 g/mL，分装，4℃保存备用。

1.5.3 有机溶剂萃取物的制备 称取佩兰醇提物10 g加入适量蒸馏水进行混悬，按照石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇的极性自低到高依次进行萃取，各萃取三次，分别合并各项萃取液，浓缩为1 g/mL，4℃保存备用。

1.5.4 CIP原液的配制 取乳酸环丙沙星原粉0.2304 g，加蒸馏水10 mL溶解，经微孔滤器过滤除杂菌，分装至EP管中，－20℃保存备用。

1.6 30味中药水、醇提取物对pf－cc最低抑菌浓度(MIC)的测定 将单味中药水提物与醇提物分别用合适的溶剂溶解后，参照文献［9］中的方法，用链球菌液体培养基按照试管二倍稀释法进行倍比稀释，根据菌落计数结果，将幼龄菌液稀释至适当浓度(即菌液浓度为1×104～1×105CFU/mL范围内)，分别加入适量稀释菌液于倍比稀释的药液中，37℃震荡培养18～24 h后，于血琼脂板上划线培养，观察细菌生长情况，重复3次，确定各中药的MIC。

1.7 中药与抗生素联合应用的部分抑菌浓度(FIC)测定 选用筛选得到的对pf－cc有抑菌作用的中药与环丙沙星联用，采用棋盘法，按照各中药2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC 浓度的顺序，在棋盘管中沿Y轴方向(自上向下)添加200 μL中药液于EP管中。按照环丙沙星的1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC浓度顺序，沿 X轴方向(自左向右)添加200 μL环丙沙星于EP管中，保证试管中实际浓度为计划浓度［10］。根据菌落计数结果，将对数生长期的菌液稀释至适当浓度(即菌液浓度在1×104～1×105CFU/mL范围内)，分别加适量于EP管中。37℃震荡培养18～24 h，蘸取培养液接种于MHA琼脂板上，37℃静置培养18～24 h，观察结果，重复三次，计算中药与抗生素联合应用的FIC值，并判定是否有协同作用或相加作用。

判定标准:以部分抑菌浓度FIC指数作为联合药敏试验的判定依据。

(FIC指数:≤0.5协同作用，0.5～1相加作用，1～2无关作用，＞2拮抗作用)。

1.8 佩兰醇提物的四种溶剂萃取物对MIC的测定依照1.6的方法分别检测佩兰醇提物的石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物对猪源链球菌的MIC。

1.9 佩兰四种溶剂萃取物与环丙沙星联合应用FIC的测定 依照1.7的方法测定佩兰四种溶剂萃取物分别与环丙沙星联用对pf－cc株的FIC，并判定中药提取物与环丙沙星合用是否具有协同或相加作用。

2 结果

2.1 中药提取物对猪源链球菌pf－cc的MIC测定 中药水、醇提取物对pf－cc的MIC值测定结果见表1。佩兰、黄连、土茯苓、枳壳、郁金5味中药醇提物、水提物抑菌作用相对较强，其中佩兰醇提物的抑菌效果相对最强，其他25味中药的醇提物、水提物的MIC值均大于或等于500 mg/mL，抑菌作用相对较弱。

2.2 中药与环丙沙星联合应用对猪源链球菌(pfcc)的FIC测定 30味中药水提物、醇提物与环丙沙星联合应用抑菌结果见表2。佩兰醇提物、黄连醇提物与环丙沙星对pf－cc分别呈现协同抑菌作用、相加抑菌作用，其余28味中药提取物与环丙沙星联合应用对pf－cc的FIC值均大于1，呈无关作用。

表1 中药对pf-cc的MIC测定 (mg·mL－1)

表2 中药提取物与环丙沙星联合应用对pf-cc的FIC值测定

2.3 佩兰四种溶剂萃取物对pf－cc的MIC测定佩兰四种溶剂萃取物对pf－cc的MIC测定结果见表3，佩兰醇提物的氯仿、乙酸乙酯萃取物的体外抑菌作用相对较强，其中佩兰乙酸乙酯萃取物抑菌作用最强，佩兰醇提物的石油醚、正丁醇萃取物的体外抑菌作用相对较弱。

表3 佩兰四种溶剂萃取物对pf-cc的MIC测定(mg·mL－1)

2.4 佩兰四种溶剂萃取物与环丙沙星联用对pfcc的FIC测定 佩兰四种溶剂萃取物与环丙沙星联用对pf－cc的FIC值见表4。

表4 佩兰四种溶剂萃取物与环丙沙星联用对pf-cc的FIC值测定

试验结果表明，佩兰醇提物的氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物分别与环丙沙星合用对pf－cc呈现相加作用，协同作用。

3 讨论

试验选取的30味清热解毒、理气、祛风除湿类的中药提取物对临床分离猪源链球菌的MIC值不一致，推测源于各中药的抑菌活性成分存在差异。30味中药醇提物体外抑菌作用均相对较强于其水提物体外抑菌作用，表明同一药材的不同提取方法能够使其呈现不同程度的抑菌活性，另外，水煎法的高温提取适合热稳定的药材，此过程将破坏部分热稳定性较差药材的有效抑菌成分，且水提物中只包含了水溶性成分，而醇提法能够有效克服水煎法的高温破坏作用［11］，从而增强醇提物的体外抑菌作用。

试验测定的黄连、马齿苋等部分中药醇提物对猪源链球菌体外抑菌作用结果与张红英［12］、赵恒章［13］等测定部分中药醇提物对猪源链球菌体外抑菌作用结果基本一致;菊花、山豆根等部分中药水提物、醇提物对猪源链球菌的体外抑菌作用结果与刘洋［14］等测定的部分中药对猪源链球菌的体外抑菌结果差异较大，由于中药成分复杂，部分中药的产地、采收时间、加工炮制以及储存方法等因素的不同均能导致成分差异［15］。试验测得鱼腥草等部分中药体外抑菌作用不显著，但应用于兽医临床抗感染效果良好［16］，因此上述中药的体内抗感染作用效果还有待于进一步验证。

试验测得佩兰醇提物及其醇提物的乙酸乙酯萃取物对pf－cc的MIC值最低，均为62.5 mg/mL，即二者对pf－cc的体外抑菌作用相对最强。佩兰醇提物与其醇提物的乙酸乙酯萃取物对pf－cc的体外协同抑菌作用略有差异，推断由于佩兰醇提物的乙酸乙酯萃取物成分相对于其醇提物较单一，导致与环丙沙星联合抑菌作用产生一定程度的影响。佩兰醇提物与其他喹诺酮类药物及其他类抗菌药物联用对pf－cc是否能够呈现协同抑菌作用还有待研究，与环丙沙星联合应用于动物体内有无较强协同抑菌作用亦有待于进一步研究。

综上所述，试验初步筛选得到与环丙沙星合用对猪源链球菌有较强体外协同抑菌作用的佩兰醇提物及佩兰醇提物的乙酸乙酯萃取物，为进一步研发新型抗菌药物制剂奠定了基础。

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