高强度聚焦超声治疗对肝癌细胞裸鼠移植瘤低氧诱导因子表达和细胞凋亡的影响

付志豪，武 伦，乔正荣，周世骥，李生伟*

(重庆医科大学 附属第二医院 1.肝胆外科； 2.胃肠外科， 重庆 400010；3.重庆市第五人民医院 普外科， 重庆 400062)

研究论文

高强度聚焦超声治疗对肝癌细胞裸鼠移植瘤低氧诱导因子表达和细胞凋亡的影响

付志豪1，武 伦1，乔正荣3，周世骥2，李生伟1*

(重庆医科大学 附属第二医院 1.肝胆外科； 2.胃肠外科， 重庆 400010；3.重庆市第五人民医院 普外科， 重庆 400062)

目的探讨高强度聚焦超声(HIFU)治疗后的残余肝癌组织中低氧诱导因子(HIF-1α)、P53和凋亡的变化及关系。方法建立肝癌HpG2细胞系裸鼠移植瘤模型30只，采用CZF-Ⅱ型HIFU治疗仪治疗,随机分为对照组、治疗后1、3及5 d和1及2周组。HE染色观察标本病理变化；TUNEL法检测残余癌组织凋亡及计算凋亡指数；免疫组化、Western blot和实时荧光定量 PCR技术检测HIF-1α、P53蛋白和mRNA水平。结果治疗后有残余肿瘤细胞和大片坏死区域。与其他组相比，凋亡指数在3 d组显著升高(Plt;0.05)，在5 d、1和2周组逐渐下降。HIF-1α和P53蛋白在各组中出现强弱不同的表达。HIF-1α和P53蛋白和mRNA在治疗后1～3 d表达逐渐升高，在3 d组显著高于其他组(Plt;0.05)，在5 d、1和2周组逐渐下降。结论HIFU治疗肝癌细胞裸鼠移植瘤后可以促进残余癌细胞凋亡，此可能与HIF-1α、P53基因表达异常关系密切。

肝癌;低氧诱导因子;凋亡;高强度聚焦超声

肝癌(hepatocellular carcinoma)是一种常见的消化系统恶性肿瘤，手术切除一直是首要的治疗手段。但由于肝癌的早期症状与体征不明确，致使大多患者在确诊时就已错过最佳手术治疗时机。高强度聚焦超声(high-intensity focused ultrasoun-d,HIFU)是一种对实体肿瘤进行非侵入性治疗的局部治疗手段[1]，为中晚期肝癌的治疗提供了契机。但是HIFU治疗后残余肿瘤组织是影响疗效的主要因素。研究发现，HIFU治疗对肿瘤的微血管产生损害，导致残余癌组织微环境低氧[2]。低氧会诱导机体产生一系列因子，其中最重要的是HIF-1α。同时低氧也可以诱导的P53表达增多，而P53是细胞凋亡最主要因子之一[3]。本研究通过建立人肝癌裸鼠移植模型，观察HIFU治疗后残余癌组织中细胞凋亡与HIF-1α、P53的表达情况。

1 材料与方法

1.1 实验材料

清洁级，裸鼠30只，6 ～8周龄，雌雄不限，体质量18 ～20 g[重庆医科大学动物实验中心，合格证号SCXK(渝)2012-0001 ]，混合饲料，隔笼喂养。

鼠抗人单克隆抗体HIF-1α、P53(Abcam公司)，TUNEL试剂盒(Roche公司)，免疫组化试剂盒(中衫金桥公司)，RT reagent Kit(Takara公司)，RNA抽提试剂盒(Omega公司)，反转录试剂盒(Takara公司)。

1.3 方法

1.3.1 裸鼠肝癌移植瘤模型的建立、分组及治疗方式：30只裸鼠, 用0.25%胰蛋白酶消化呈单个的人肝癌细胞HpG2(由重庆医科大学生命科学院实验室惠赠)细胞，调整细胞数至1×107/mL，在裸鼠右侧前颈部皮下接种细胞悬液0.1 mL。待裸鼠皮下移植瘤直径约0.5 ～1.0c m时，使用CZF-Ⅱ型超声治疗仪，输入治疗参数(探头频率8.6 MHz，脉冲1 000 Hz，功率5 W)，治疗时间为30 s。非治疗组不给于任何处理。对照组、HIFU治疗后1、3及5 d和1及2周各取5只裸鼠颈椎脱臼法处死，收集标本。

1.3.2 HE染色观察各组肿瘤组织的病理变化：处死裸鼠后，标本使用4%多聚甲醛固定24 h后，给予常规脱水，透明浸蜡和包埋。石蜡切片，厚约4 μm，每组标本取5片HE染色，光镜下观察。

1.3.3 缺口末端核苷标记法(TUNEL)检测凋亡及计算凋亡指数：取出各组标本，具体步骤按TUNEL试剂盒说明书进行。阳性标准:显微镜下肿瘤细胞系显色棕黄色颗粒为阳性，每组随机取5个高倍视野(×400)，计算凋亡指数(AI)=阳性细胞数/肿瘤细胞数×100%。

1.3.4 免疫组化检测各组肿瘤组织中的HIF-1α和P53蛋白变化：取出各组标本，采用免疫组化SP法检测各组HIF-1α、P53蛋白表达情况。具体步骤按照免疫组化试剂盒说明书进行。阳性标准：在显微镜下，胞质或胞核出现棕黄色为阳性。

1.3.5 Western blot 检测各组肿瘤组织中的HIF-1α和P53蛋白含量：取出各组标本，提取组织蛋白、制备SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、洗涤等过程，然后显影，分析结果。

1.3.6 实时荧光定量PCR法检测各组基因HIF-1αmRNA和P53 mRNA的表达。将组织磨碎，提取无RNase的水溶解RNA，RNA定量。反转录参照试剂盒，荧光定量聚合酶链反应扩增条件为95 ℃预变性2 min；随后95 ℃ 10 s，退火温度15 s，72 ℃ 延伸45 s，共40个循环；最后72 ℃延伸10 min。上游引物5′-AAACCTAAATGTTCTGCCTAC-3′，下游引物5′-GGATGTTAATAGCGACAAAGT-3′。P53:上游引物5′-CCTCCTCAGCATCTTATCCG-3′，下游引物 5′-TGGTACAGTCAGAGCCAACCT-3′。采用ΔΔCT法进行实时定量PCR相对定量反应，计算相对含量。

（1）让学生改变角色，想象自己是孟母。（2）小组讨论：孟母在这样的环境，看到孟子的表现，她有什么感受？有何打算？

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 移植瘤HIFU治疗后的肉眼改变。

与对照组相比，1 d组标本的消融区域可见到成灰白色的凝固性坏死，周围存在残余肿瘤组织。在消融后3及5 d和1及2周组的标本可见靶向区存在陈旧性坏死 (图1)。

2.2 光镜下HIFU治疗后移植瘤的病理变化

与对照组相比,在1 d组的消融区出现大量坏死，在空白区域之间有残留肿瘤细胞。在3 d组的消融靶区边缘可见少量小血管和正常的肿瘤细胞，同时纤维组织增生，逐渐将坏死区域包裹。在5 d和1及2周组中残余肿瘤细胞也在逐渐增生(图2)。

2.3 在光镜下TUNEL检测残余肿瘤的凋亡结果

在各组观察的细胞凋亡，可见细胞系呈棕黄色颗粒的凋亡细胞(图3)。与对照组相比，在1 d组凋亡指数出现升高(Plt;0.05)。在3 d组达到高峰，在5 d和1及2周组凋亡指数呈现下降趋势(图4)。

2.4免疫组化检测HIF-1α、P53蛋白在各组的表达

在显微镜下，HIF-1α蛋白的表达定位于肿瘤细胞胞质，P53蛋白的表达定位于细胞系出现棕黄色颗粒。在对照组，可见胞质或胞核染色浅，数量也较少。消融后胞质或胞核染色逐渐加深，而且数量也逐渐增加(图5)。

A.control group；B.1 day group图1 HIFU治疗后的移植瘤变化Fig 1 The changes of xenograft after treatment by HIFU

A.contol group；B.1 day group；C.1 week group图2 不同组肿瘤的形态学改变Fig 2 Changes of morphology on tumorous tissues in different groups(HE ×200)

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with other groups图4 凋亡指数在各组情况Fig 4 Apoptosis index in different groups

2.5Westernblot检测HIF-1α和P53蛋白在各组的表达

治疗后HIF-1α和P53蛋白表达逐渐升高，在3 d组达到高峰(Plt;0.05)。在5 d和1及2周组HIF-1α和P53蛋白的表达呈现逐渐下降(图6)。

2.6实时荧光定量PCR技术检测HIF-1α、P53mRNA水平

治疗后HIF-1α和P53 mRNA水平逐渐升高，在3 d组达到高峰(Plt;0.01)。在5 d和1及2周组HIF-1α和P53 mRNA的表达呈现逐渐下降(图7)。

3 讨论

HIFU是中晚期癌症的一种安全易行的局部非侵入治疗方法[4]，已在部分良恶肿瘤中广泛应用[5]，但在肝癌治疗时由于肋骨遮挡、热沉积效应、呼吸运动和定位方式存在治疗盲区等因素，引起残癌细胞的存在，而后者正成为影响HIFU治疗肝癌效果的关键环节[6]。因此，弄清残癌细胞的凋亡规律可能为尽可能的杀伤残癌组织、提高HIFU治疗效果而备受关注。本实验结果显示HIFU治疗肝癌细胞裸鼠移植瘤后，第1天肿瘤细胞凋亡指数显著增加，3 d时达到高峰，随后下降，2周时凋亡指数回到基线水平。此与HIFU消融兔肝后消融区域周围出现的细胞凋亡变化规律相一致[7]。由此可见HIFU治疗肝癌细胞裸鼠移植瘤后可以促进残余癌细胞凋亡，其效应的时间窗为2周。

本实验通过检测HIFU治疗后残余肿瘤组织中HIF-1α表达情况，发现其在治疗后1 d显著升高，在3 d时达到高峰，随后下降。研究表明HIFU治疗肿瘤时可以对肿瘤的微细血管造成严重损伤，从而导致残余肿瘤组织的微环境低氧[2]。低氧可以引起HIF-1α的表达和聚集，它通过促进红细胞生成，血管形成，核苷、氨基酸、糖的能量代谢，细胞存活，凋亡等生物学效应使机体、 组织、细胞适应低氧环境[8-9]。此可能部分解释了HIFU治疗早期残癌细胞中HIF-1α表达上调。而另一方面已证实HIF-1α主要在氧浓度0%～2%之间稳定聚集[10]，随着消融时间的延长，血管新生和单个残癌细胞微环境氧含量的增多，HIF-1α会被迅速降解。本实验亦观察到HIF-1α表达达峰后随着HIFU治疗时间延长表达下调，同时还发现HIF-1α表达与残癌细胞凋亡指数变化的时间点规律一致。关于HIFU治疗后HIF-1α与残癌细胞凋亡的机制尚不清楚，既往研究表明P53在低氧微环境时表达，而表达稳定性与HIF-1α相关[11～12]。HIF-1α可以通过与MDM2结合，促进P53基因的稳定从而促进低氧区域细胞凋亡[13]。因此本研究进一步观察了P53在残余肿瘤组织中表达情况，结果发现P53与HIF-1α和凋亡指数出现显著升高的时间点基本一致。推测HIFU治疗引起肝癌细胞裸鼠移植瘤的残癌细胞凋亡作用可能与HIF-1α、P53基因表达异常关系密切，确切的信号通路机制本实验课题组正在探讨中。总之，HIFU治疗肝癌细胞裸鼠移植瘤后可诱导残余癌细胞凋亡，此效应可能与HIF-1α、P53基因表达异常关系密切;调控HIF-1α基因的表达有望成为HIFU治疗后残余癌组织靶向杀伤作用的潜在靶点，这为增强HIFU治疗效果提供了新方法。

A.control group(weak) ； B.1 day group(moderate) ；C.3 days group(strong); D.control group (weak) ； E.1 day group(moderate) ；F.3 days group(strong)

图5免疫组化检测HIF-1α、P53蛋白表达的情况
Fig5ExpressionofHIF-1α,P53intumoroustissuesofdifferentgroups(Immunohistochemistry×400)

*Plt;0.05 compared with control group； #Plt;0.05 compared with other groups图6 HIF-1α和P53蛋白在各组肿瘤组织中的表达Fig 6 Expression of HIF-1α,P53 in tumorous tissues of different groups detected by Western blot(±s,n=5)

*Plt;0.05 compared with control group； #Plt;0.01 compared with other groups图7 实时荧光定量 PCR检测HIF-1α、P53 mRNA在各组中的表达

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Effect of HIFU on hypoxia-inducible factor (HIF-1α)expression and cell apoptosis in liver cancer cell xenografts of nude mice

FU Zhi-hao1, WU Lun1, QIAO Zheng-rong3, ZHOU Shi-ji2, LI Sheng-wei1*

(1.Dept. of Hepatobiliary Surgery; 2.Dept. of General Surgery, the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical UniversityChongqing 400010; 3.Dept. of General Surgery,People’s Five Hospital of Chongqing,Chongqing 400062,China)

ObjectiveTo study the effects of hypoxia-inducible factor (HIF-1α) on apoptosis of the residual tumor cells in nude mice after treatment by high-intensity focused ultrasound (HIFU).MethodsHuman HCC implantation was established in 30 nude mice. CZF-Ⅱ HIFU therapeutic apparatus was used for treatment.Nude mice were randomly divided into control group and treatment group (included 1 d group, 3 d group, 5 d group, 1 week group,and 2 weeks group). Pathological changes were observed with HE staining;Cell apoptosis was detected by DNA agarose gel electrophoresis and terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated Dutp nick end-labeling (TUNEL) assay; SP immunohistochemistry was used to detect HIF-1α protein;Western blot and real-time quantitative PCR were used to detect HIF-1α, P53 protein and mRNA expression levels.ResultsHE showed that there were residual tumor cells and large necrotic areas after treatment. Compared with other groups, the apoptosis index

in 3 d group was significantly higher (Plt;0.05), while in the 5 d group,1 week group,2 weeks group gradually decreased. Immunohistochemistry showed that the expression of HIF-1α, P53 protein was different in each group. Compared with other groups,Western blot and RT-PCR showed an increase of HIF-1α, P53 protein and mRNA levels in groups after treatment of 1 to 3 days, and peaked in 3 d group(Plt;0.05).ConclusionsHIFU treatment can induce consistent apoptosis in residual tumor, which may be related with disordered expression of HIF-1α and P53.

liver neoplasms; hypoxia-inducible factor; apoptosis; high-intensity focused ultrasound

2013-06-21

2014-03-22

国家自然科学基金 (81301975,81272570);重庆市卫生局重点资助项目(渝卫2012-1-040,渝卫2010-1-68)

*通信作者(correspondingauthor)：lswgg@126.com

1001-6325(2014)05-0648-06

R 735.7

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